【引言】

由于競爭性

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)遵循抗原-抗體特異性反應原理，具有檢測時間短、成本低、工藝簡單等特點。ELISA主要分為夾心ELISA和競爭性ELISA。夾心ELISA通過第一抗體捕獲系統(tǒng)中的抗原，然后通過標記抗體形成抗體-待測分子-抗體的夾心復合物，并向前產生免疫識別信號。而競爭性ELISA是通過目標分析物與人工抗原共同競爭結合抗體，并隨著目標分析物濃度的升高而反向產生免疫應答信號。長期以來的觀點是，小分子不能同時與兩種親和物兼容，并且不可能開發(fā)小分子的夾心ELISA方法。

因此，夾心

然而近年來，多位研究者建立了許多分子量小于1000 Da的夾心ELISA方法，驗證了夾心ELISA適用于小分子的檢測，并且有高檢測靈敏度。為了開發(fā)靈敏度更高的夾心ELISA，抗原表位之間的距離應該有多大?表位之間的距離應該有多大才能不影響夾心復合體的形成效率?作者從檢測方法的應用出發(fā)，將夾心法靈敏度不低于競爭法的表位之間的距離定義為，并將沒有位阻而形成夾心復合物的表位之間的距離定義為。。

　　硝基呋喃酮是一種禁用抗生素，經常在水產養(yǎng)殖中非法使用。它在體內代謝迅速，縮氨基脲(SEM)是硝基呋喃酮的小分子(75 Da)代謝物，中國國家標準規(guī)定，動物源性食品中不能含有SEM。SEM可與鄰硝基苯甲醛(NBA)進行高回收率衍生化反應。針對這種SEM- NBA衍生物的抗體可用于SEM免疫分析。在這項研究中，作者使用了幾種SEM衍生物來評估兩個表位之間的距離對夾心免疫測定靈敏度的影響(圖1)，并以此探索小分子夾心復合物的形成規(guī)律。

　　圖1夾心原理及衍生化示意圖

　　【內容介紹】

第一個

作者先是使用衍生化試劑，通過不同長度的飽和碳鏈連接模型分子，構建了SEM - NBA -間隔臂(Cn)-生物素化合物，作為檢測目標物。之后采用夾心ELISA法測定表位SEM - NBA-間隔臂-生物素之間的優(yōu)勢距離和最佳距離(間隔臂長度升序排列)。夾心ELISA采用兩種實驗方案，包被抗體均為抗SEM - NBA抗體，目標檢測物為不同長度間隔臂的SEM - NBA -間隔臂(Cn)-生物素，二抗為酶標抗生物素抗體或親和素，原理如圖1。以空白+ 3 SD(n = 6)為檢出限。

　　小分子夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的失敗不是由其分子量直接引起的，而是由于表位之間的距離太小而引起的位阻。如果兩個表位之間的距離足夠大，小分子也可以被夾心結合。研究表明，兩個表位之間的距離越短，所需的親和反應時間越長，檢測靈敏度越差。通過增加反應濃度或延長被測小分子的孵育時間，可以提高該限度;但靈敏度過低，培養(yǎng)時間過長，不利于該方法的實際應用。

　　圖2不同間隔臂夾心ELISA對sem - nba -間隔臂生物素的吸光度值

藍線

圖2中的表示在雙抗體夾心模式下，不同間隔臂對復合物形成的影響。當丙二醇(propanediol)作為間隔臂時，吸光度超過了檢出限。此時，兩個表位之間的距離為12 Å，是該模式下的優(yōu)勢距離。當1,6-己二醇(1,6-hexanediol)作為間隔臂時，吸光度值達到平臺值，表明兩種抗體之間沒有位阻。在這種情況下，兩個表位之間的距離為16 Å，這是該模式下的最優(yōu)距離。圖2中的表示在抗體-親和素夾心模式下，不同間隔臂對復合物形成的影響。以1,3-丙二醇(1,3-propanediol)為間隔臂時，吸光度超過了檢測限。此時，兩個表位之間的距離為13 Å，這是該模式下的優(yōu)勢距離。而以1,6-己二醇(1,6-hexanediol)為間隔臂時，吸光度達到平臺值。在這種情況下，兩個表位之間的距離為17 Å，這是該模式下的最優(yōu)距離。這些發(fā)現(xiàn)表明，雙抗體夾心法親和力和抗體-親和素夾心法親和力對表位之間的距離有相似的要求。

　　圖3 SEM夾心ELISA標準曲線(n = 6)

夾心

圖3為夾心ELISA SEM標準曲線。雙抗體夾心和抗體-親和素夾心的EC50值分別為11.2和7.3 pg/mL(SEM計算)，最終檢測溶液的LOD分別為1.5和0.7 pg/ mL(空白+ 3SD)。與使用相同抗體建立的競爭性ELISA相比，。該方法的最大優(yōu)點是預處理簡單。傳統(tǒng)的SEM競爭性ELISA需要在通風柜中進行復雜的提取和濃縮過程，以獲得低LOD。然而，作者所開發(fā)的夾心ELISA只需要稀釋以消除基質干擾，即可實現(xiàn)組織樣品的LOD分別為30 ng/kg(雙抗體夾心)和14 ng/kg(抗體親和素夾心)。

　　作者以魚和蝦為實驗對象，對構建的夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的準確性進行了評價。采用靈敏度較高的抗體-生物素夾心ELISA法檢測樣品。樣品經HPLC-MS/MS(未檢測出SEM)鑒定為陰性樣品，在兩個陰性樣品中分別以30 ng/kg和100 ng/kg的劑量給藥SEM。采用本研究建立的夾心ELISA法對陰性和給藥樣品進行檢測。五個陰性樣本的檢測沒有產生假陽性結果，表明樣品中的天然生物素不會影響夾心ELISA的結果，因為干擾物質在ELISA洗板步驟中被去除。而給藥樣品的平均回收率為75% ~ 89%，平均相對標準偏差為13%，表明該方法可用于實際樣品的檢測。

　　【結論】

　　作者研究的新方法具有幾個優(yōu)點，包括靈敏度提高(30倍)、簡單的操作過程、環(huán)保，在樣品預處理過程中不需要提取、干燥或濃縮。所有硝基呋喃代謝物都含有一個肼基團;因此，從理論上講，夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗的衍生試劑和路線一般適用于其他硝基呋喃代謝物的檢測。

　　原文出處linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S030881462301453X

　　指導老師：王戰(zhàn)輝