【引文】
提高抗體對抗原親和力是提高免疫分析方法靈敏度的有效手段，但是通過免疫動物產生的傳統(tǒng)抗體，其親和力容易受到免疫耐受的限制，且由于其結構復雜，不易于體外改造。相比而言，單域抗體（sdAb），也被稱為納米抗體，因其納米級尺寸、良好的水溶性、對惡劣環(huán)境的高耐受性和易于基因操作的特點而更適合于體外誘導親和成熟。目前已有研究者嘗試了許多體外誘導納米抗體親和力提高的方法，但是突變的隨機性使得篩選過程耗時費力，限制了這些方法的應用。本研究通過蛋白質同源建模和分子對接的組合策略以提供精準的蛋白質預測模型，選擇納米抗體抗赭曲霉毒素A（AOA-sdAb）作為模型抗體，分析赭曲霉毒素A（OTA）與AOA-sdAb間的分子相互作用，探索提高親和力的可行途徑。針對抗赭曲霉毒素A抗體中Nb28關鍵結合位點，通過丙氨酸掃描確認Gly53、Met79、Ser102和Leu149為關鍵氨基酸，通過對這4個關鍵氨基酸進行定點突變，構建了兩個定點飽和突變文庫，獲得了親和力提高的突變體Nb-G53Q&S102D，其半數最大抑制濃度（IC50）為0.29 ng/mL, KD值為52 nM，分別比原sdAb降低1.4倍和1.36倍。計算機模擬分析表明，氨基酸殘基的氫鍵、疏水相互作用和側鏈位阻對AOA-sdAb的結合親和性至關重要。
【內容介紹】
1. 同源建模與分子對接
將Nb28的氨基酸序列提交至SWISSMODEL在線服務器獲取其三維結構，從50個同源模板中選擇相似度為54.88%，GMQE值為0.17，QMEAN評分為- 1.48的目標模板，其中z分數是通過將Nb28模型的歸一化原始分數（綜合QMEAN評分和單個平均力勢項）與PDB數據庫中的一組高分辨率x射線結構進行比較來計算的。如圖1A所示，Nb28蛋白模型的Z-score位于一個相對準確的區(qū)域，表明Nb28模型的大部分氨基酸殘基與預測特征吻合較好。此外，Ramachandran圖分析顯示，87個殘基（94.6%）位于有利區(qū)域，5個殘基（5.4%）位于可接受區(qū)域（圖1B）。表明Nb28模型的所有骨架扭轉角都在可信范圍內。說明了所選擇的Nb28同源性模型是合理的。
為了預測Nb28更穩(wěn)定的三維結構，在隱式溶劑環(huán)境下對全原子分子進行了動態(tài)模擬。動力學仿真前200 ps的均方根偏差（RMSD）值如圖1C所示。RMSD值在前10 ps快速增加，在10 – 200 ps范圍內在1.2 Å左右輕微波動，具有軌跡的代表性結構特征，可認為預測的Nb28在200 ps內幾乎是恒定的。利用Autodock 4.2將能量最小化后的穩(wěn)定結構與OTA對接，如圖1D所示，其中預測OTA與Nb28通過Gly53、Met79、Ser102、Val147和Leu149相互作用，涉及疏水相互作用和氫鍵。這些殘基依次分布在Nb28的FR1、CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域。這一結果說明Nb28的三個高變區(qū)中上述五個殘基可能與其抗原結合活性有關。
圖1. 最適模型的擬合曲線。（A）z得分結構數據庫，（B）Nb28模型的Ramachandran圖分析，（C）第一個200 ps Nb28的分子動力學模擬和結構，（D）Nb28和OTA的分子對接模型。
為了證實上述結論，進行了丙氨酸掃描實驗，分別在Gly53、Met79、Ser102、Val147和Leu149位點引入了單點突變。然后，表達和純化5個Nb28突變體（Nb-Gly53Ala、Nb-Met79Ala、NbSer102Ala、Nb-Val147Ala和Nb-Leu149Ala），并通過ELISA分析其活性。如圖2A所示，與親本sdAb Nb28相比，三個突變體（Nb-Gly53Ala、Nb-Met79Ala和Nb-Leu149Ala）的抗原結合活性顯著降低。Nb-Ser102Ala和Nb-Val147Ala均保留了Nb28的抗原結合活性。然而，在間接競爭ELISA中，NbSer102Ala的敏感性比Nb28高1.5倍，NbVal147Ala沒有觀察到顯著變化（圖2B）。因此，Gly53、Met79、Ser102和Leu149可以被識別為Nb28與OTA相互作用的關鍵氨基酸位點，這證實了圖1D中的分子對接結果。
圖2. Nb28與丙氨酸掃描突變的活性分析。（A）Nb28及其突變體抗原結合能力間接ELISA標準曲線，（B）Nb28、Nb-Ser102Ala和Nb-Val147Ala的標準競爭抑制曲線。
2. 突變和噬菌體選擇
使用Mut Express II Rapid Mutagenesis Kit V2將兩個位點飽和突變引入Nb28的DNA序列，構建Gly53&Ser102-mLib和Met79&Leu149-mLib，計算存儲容量。然后對兩個突變文庫進行4次生物篩選，從每個文庫中隨機抽取40個克隆進行噬菌體擴增，結果如圖3A所示，所有Gly53&Ser102-mLib克隆均為陽性，隨后，隨機選取15個克隆進行DNA測序，得到6個不同的序列，如圖3C所示。與噬菌體VHH28的序列相比，15個突變克隆的序列在Gly53（Nb-Gly53Asp、Nb-Gly53Lys、Nb-Gly53Leu和Nb-Gly53His）或Ser102（Nb-G53Q&S102D和Nb-Ser102Tyr）上均有兩個位點突變。然而，從Met79和Leu149- mlib中選擇的克隆在450 nm處的吸光度明顯低于噬菌體VHH28（圖3C），這表明引入Met79和Leu149位點的突變可以顯著降低噬菌體VHH28的結合活性。
圖3. 突變噬菌體克隆的選擇和測序。（A）Gly53&Ser102-mLib和（B）Met79&Leu149-mLib噬菌體克隆的間接競爭性ELISA鑒定，（C）Gly53&Ser102-mLib克隆的6個DNA序列分析。
3. 突變體的表征和鑒定
6個不同序列突變體中VHH-G53D&S102Q、VHH-G53K&S102Q、VHH- G53Q & S102D三個克隆的靈敏度較高。選擇IC50最小的克隆VHH-G53Q&S102D構建重組表達質粒。自動誘導表達和純化后獲得分子量約為18 kDa的Nb-G53Q&S102D，Nb-G53Q&S102D（IC50: 0.29±0.03 ng/mL）的靈敏度比預期的Nb28（IC50: 0.41±0.01 ng/mL）高1.41倍（圖4B）。并對兩種單克隆抗體的熱穩(wěn)定性和特異性進行了測試，結果表明Nb-G53Q&S102D在改變其親本sdAbs中負責結合抗原的殘基后仍保持了結構穩(wěn)定性，具有更高的靈敏度、熱穩(wěn)定性和特異性。
圖4. 突變體的鑒定和表征。（A）噬菌體克隆VHH28、VHH-G53D&S102Q、VHH-G53K&S102Q、VHH-G53L&S102Q、VHH-G53H&S102Q、VHH-G53Q&S102D、VHH-G53Q&S102Y的競爭抑制標準曲線，（B）Nb28和Nb-G53Q&S102D的競爭抑制標準曲線，（C）Nb28和Nb-G53Q&S102D分別在20、30、40、50、60、70、80和90°C孵育5分鐘，在20°C下冷卻10分鐘，（D）分別在90°C下孵育0、5、15、25、35、45和55分鐘，然后在相應時間的RT下冷卻后的保留活性。
4. sdAb與OTA交互作用分析
采用“熱泳與T跳”評價策略，進行了sdAb與OTA的相互作用親和分析，NbG53Q&S102D的親和力比Nb28高1.36倍，該結果表明，本研究中使用的策略在生成和篩選具有改進的OTA親和力的sdAb方面是有效的。為了研究sdAb與OTA的作用機制，通過同源性建模和分子對接來探討sdAb與OTA關鍵氨基酸的相互作用。與噬菌體克隆VHH28相比，從Met79和Leu149 - mlib中選擇的突變噬菌體克隆的抗原結合活性顯著降低（圖3B）。此外，引入Nb28的Met79的丙氨酸突變可以使抗體失活（圖2A）。這些結果可歸因于Nb28的Met79被其他氨基酸取代，破壞了Met79與Tyr137之間形成的氫鍵（紅點線），如圖5B所示，對于突變的Nb-G53Q&S102D的第102位氨基酸，天冬氨酸和酪氨酸都可以與Lys107和OTA形成氫鍵，分別如圖5C和D所示。但克隆VHH-G53Q&S102Y在噬菌體ELISA中的敏感性（IC50: 0.87±0.12 ng/mL）低于克隆VHH-G53Q&S102D（IC50: 0.11±0.01 ng/mL），推測S102Y側鏈的位阻更強可能導致抗體親和力降低。如圖5E所示，Nb28的Leu149通過氫鍵和疏水相互作用與OTA相互作用。
圖5. sdAbs與OTA的相互作用分析。（A）Nb28和Nb-G53Q&S102D的歸一化熒光變化，（B）Nb28的Met79與OTA的相互作用，（C）Nb-G53Q&S102D的S102D與OTA的相互作用，（D）Nb-G53Q&S102Y的S102Y與OTA的相互作用，（E）Nb28的Leu149與OTA的相互作用，（F）Nb28與OTA分子對接模型的結合孔。
雖然沒有從Met79和Leu149- mlib中選擇有效的噬菌體克隆（圖3B），但這些相互作用力與Leu149的位阻可能對Nb28對OTA的結合活性和親和力有重要影響?？紤]到Met79在Nb28結合活性中的關鍵作用，引入Leu149的單點突變可能是提高抗體親和力的另一種有效策略。如圖4A所示，Gly53和Ser102對不同氨基酸的突變對VHH28的敏感性有很大影響。由于Q102和S102都是不帶電的極性氨基酸，且具有相似的簡單側鏈，因此Nb活性口袋中涉及的第53位氨基酸的極性和側鏈位阻可能是導致突變噬菌體克隆敏感性變化的主要原因（圖5F）。隨著G53D、G53K、G53L、G53H序列中第53位氨基酸側鏈位阻的增加，相對突變噬菌體克隆的敏感性依次降低（圖4A、圖6）。VHH-G53D&S102Q、VHH-G53K&S102Q克隆的敏感性高于VHH28，這可能與G53D和G53K的極性有關。此外，第53位氨基酸的電荷可能對活性口袋有一定的影響，導致VHH-G53D&S102Q的IC50值低于VHH-G53K&S102Q（圖4A）。
圖6. 抗OTA sdAb 第53位4個氨基酸側鏈位阻的比較。（A）G53D，（B）G53H，（C）G53L，（D）G53K。
盡管His53是極性氨基酸，但VHH-G53H&S102Q的靈敏度低于VHH28。這可能是由于組氨酸具有很強的側鏈位阻作用。同樣，亮氨酸的側鏈位阻也可能是VHH-G53L&S102Q靈敏度低于VHH28的關鍵因素（圖4A）。因此，通過修飾sdAb的關鍵氨基酸可以改變sdAb與OTA的相互作用。
【結論】
通過同源性建模、分子對接和丙氨酸掃描，鑒定出AOA-sdAb Nb28的4個關鍵氨基酸（Gly53、Met79、Ser102和Leu149）。對這些氨基酸進行配對，構建了兩個位點飽和突變文庫，從文庫中篩選出了親和力比親本sdAb Nb28高1.36倍的突變Nb-G53Q&S102D。綜上所述，同源建模和分子對接結合丙氨酸掃描和兩點突變的策略適用于生成對OTA和其他毒性低分子量化合物具有更高親和力的單克隆抗體，同時計算機模擬分析表明，氨基酸殘基的氫鍵、疏水相互作用和側鏈位阻對AOA-sdAb的結合親和性至關重要。相對而言，使用同源建模和分子對接方法成本低、省時，為提高AOA-sdAb的結合親和力提供了一種有效的策略，并為sdAb對其他低分子量化合物的結合提供了模型基礎。
Wang, X. R., Chen, Q., Sun, Z. C., Wang, Y. D., Su, B. C., Zhang, C. H., Cao, H. M., & Liu, X. (2020). Nanobody affinity improvement: Directed evolution of the anti-ochratoxin A single domain antibody. International Journal of Biological Macromolecules,151, 312-321.
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.02.180
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