脊椎動物可以產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞首先作為造血干細胞出現(xiàn)在骨髓中，并分化為祖B細胞（pro-B）、前B細胞（pre-B）和未成熟的B淋巴細胞。未成熟的B淋巴細胞表面帶有可特異性結合抗原的免疫球蛋白受體。在離開骨髓之前，未成熟的B淋巴細胞上的IgM型抗原特異性受體可用于去除與自身抗原發(fā)生反應的淋巴細胞。這個過程對自身抗原的攻擊極為重要。只有對自身抗原不敏感的未成熟B淋巴細胞能夠分化為成熟的B淋巴細胞，表達IgM型和IgD型免疫球蛋白。這一過程主要發(fā)生在骨髓中，脾臟和淋巴結等次級淋巴器官也有發(fā)生。當免疫細胞遇到外來抗原時，免疫反應迅速產(chǎn)生。首先，專業(yè)的抗原遞呈細胞捕獲入侵的外來抗原，并與MHC Ⅱ類分子在細胞表面結合以呈遞免疫信息。然后，這些信息被傳遞至輔助性T淋巴細胞，輔助性T淋巴細胞被激活后選擇性刺激抗原敏感的成熟B淋巴細胞，這些B淋巴細胞在其細胞表面可與同樣的MHC復合物結合，這一現(xiàn)象也發(fā)生在抗原激活的專業(yè)抗原遞呈細胞上?？乖せ詈蟮牡诙€主要過程是變?yōu)橛洃汢淋巴細胞，記憶B淋巴細胞可以被同一抗原再次快速激活。記憶B淋巴細胞的產(chǎn)生與類別轉(zhuǎn)換和體細胞超突變有關。同一抗原的重復刺激有助于高親和力抗體的產(chǎn)生，這一過程被稱為親和力成熟。

        原始的雜交瘤技術利用日本血凝病毒（HVJ）和聚乙二醇（PEG）融合抗原致敏的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞從而產(chǎn)生雜交瘤細胞，存在大量不可控的非特異性融合。產(chǎn)生高親和力和高特異性單克隆抗體的雜交瘤技術有兩個關鍵點。第一點是B淋巴細胞分化成熟的免疫過程。第二點是靶向抗原致敏的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的選擇性融合過程。

這篇文章介紹了基于抗原對B淋巴細胞預選的新一代雜交瘤技術，并使用電脈沖將其與骨髓瘤細胞選擇性融合。

1.傳統(tǒng)雜交瘤技術

       在雜交瘤技術出現(xiàn)之前，抗體主要來自免疫動物血清的多克隆抗體，這些抗體具有不均質(zhì)性，可與幾種表位交叉反應。使用HVJ或PEG的傳統(tǒng)雜交瘤技術可產(chǎn)生具有均質(zhì)性的單克隆抗體，特異性識別單一的抗原表位，融合效率較低。

圖1：基于PEG和HVJ的傳統(tǒng)雜交瘤技術。B：B淋巴細胞；M：骨髓瘤細胞；BM:雜交瘤細胞。

2，改良的雜交瘤技術

        為了改良傳統(tǒng)雜交瘤技術，新的雜交瘤技術陸續(xù)被建立。珍珠鏈形式通過施加不均勻的交流電場，骨髓瘤細胞和免疫的B淋巴細胞在電極表面形成單層，并在電場脈沖下融合形成雜交瘤細胞。這一方法提高了融合效率，但仍舊存在脾細胞-脾細胞融合和瘤細胞-瘤細胞融合。此外，也無法控制所融合的B淋巴細胞是否具有特異性。

圖2：基于珍珠鏈形式的改良雜交瘤技術

如圖三所示的激光輻射模式，在顯微鏡下，捕獲激光轉(zhuǎn)移淋巴細胞使其與骨髓瘤細胞接觸，接著用脈沖激光束照射淋巴細胞-骨髓瘤細胞的接觸表面。這一手動操過程可以準確的控制淋巴細胞和骨髓瘤細胞之間的融合。但是耗時，也無法確定與骨髓瘤細胞融合的B淋巴細胞是否具有特異性。

圖3：基于激光輻射的改良雜交瘤技術

3.新一代雜交瘤技術-靶向B細胞

       為了實現(xiàn)特異性B淋巴細胞與骨髓瘤細胞選擇性融合，建立了脈沖電場法或B細胞靶向技術（BCT）。這一技術包括三個關鍵步驟。首先是利用免疫球蛋白受體對抗原致敏B淋巴細胞的預選。其次是通過生物素和親和素使抗原選擇的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞接觸。最后是B淋巴細胞-骨髓瘤細胞通過電脈沖選擇性融合。根據(jù)選擇B淋巴細胞的結合物，已經(jīng)開發(fā)了兩種BCT方案，即抗原-生物素（FIG4A）或抗原-親和素（FIG4B）。后一種情況也可使用抗原-鏈霉親合素。

圖4：基于BCT的新一代雜交瘤技術。Ag:抗原；Av：親和素；B：B淋巴細胞；M:骨髓瘤細胞；BM:雜交瘤細胞；NHS-Bio：羥基琥珀酰亞胺-生物素；StAv：鏈霉親合素。

      第一種方案中，抗原選擇的B淋巴細胞可以通過親和素或鏈霉親合素形成B細胞-抗原-生物素-親和素（鏈霉親合素）-B細胞復合物?？乖?生物素結合物選擇B淋巴細胞后，由于添加親和素或鏈霉親合素會形成B細胞-B細胞復合物，可能會導致抗原選擇的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞之間融合效率降低，但可以通過在生物素化抗原中加入過量的親和素或鏈霉親合素來改善。

    當使用來自牛心臟線粒體的F₀F₁-ATPase的F₀亞基作為抗原時，融合效率超過16.5%，而通過PEG介導的方法融合效率僅為1.1-5.6%。并且，鏈霉親合素具有酸性等電點（pI）,在中性pH條件下帶有負電荷，因而可抑制鏈霉親合素與帶負電的B淋巴細胞的非特異性結合。

       為了防止形成B細胞-B細胞復合物，可以使用第二種方案中的抗原-親和素（或抗原-鏈霉親合素）復合物來選擇B淋巴細胞。通過抗原-生物素或抗原-親和素（或抗原-鏈霉親合素）復合物預選得到來自抗原免疫小鼠的B淋巴細胞后，利用生物素和親和素（或鏈霉親合素）使之與骨髓瘤細胞連接。

4.BCT的應用

          根據(jù)圖4B，首先使用由49個氨基酸組成的，包含三個不同的目標肽序列長肽進行免疫，然后將三種不同的肽-親和素復合物用于預選B淋巴細胞。結果，以平均50.4%的高融合率成功產(chǎn)生了單克隆抗體。這是用PEG介導方法獲得結果的5-40倍（僅1.8-8.2%）。此外，由BCT產(chǎn)生的每種單克隆抗體對相應的肽序列顯示出高特異性。在長肽中未檢測到與其他肽序列的交叉反應。PEG方法生成的單克隆抗體沒有特異性反應，但顯示出與未指定區(qū)域的交叉反應性，與BCT方法形成鮮明對比。接著，還證實了BCT對于15個氨基酸組成的短肽序列的適用性，成功獲得基于BCT產(chǎn)生針對短肽序列的特異性單克隆抗體。

為了測試BCT對低分子量化合物的潛力，選擇鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）作為抗原。成功的產(chǎn)生針對DEHP的新型高親和力單克隆抗體，該抗體與其他鄰苯二甲酸酯衍生物幾乎沒有交叉反應。克隆雜交瘤細胞后，解離常數(shù)（Kd）值介于10^-9和10^-11之間。

因此，BCT可用于有效產(chǎn)生針對肽和低分子量化合物的單克隆抗體。從理論上說，BCT產(chǎn)生的所有雜交瘤細胞都可以分泌所需的單克隆抗體。

5.體外免疫

      免疫通常必須在體內(nèi)進行，并且需要幾個月的時間才能完成。如果免疫可以在短期內(nèi)完成，那肯定會促進單克隆抗體的迅速產(chǎn)生。因此本文提出體外免疫，將未免疫小鼠的脾細胞與胞壁酰二肽、IL-4、脂多糖和靶標抗原于37℃在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。免疫熒光分析即可檢測到一些抗原選擇的B淋巴細胞，并且通過熒光激活細胞分選分析還發(fā)現(xiàn)了IgM和IgD雙陽性成熟B淋巴細胞。然而，BCT體外免疫后產(chǎn)生的單克隆抗體表現(xiàn)出相對較寬的交叉反應性。

6.多靶標技術

傳統(tǒng)方法中一只小鼠產(chǎn)生針對一種抗原的單克隆抗體。如果僅使用一只小鼠產(chǎn)生針對多種抗原的單克隆抗體，將有助于小鼠的保護并減少產(chǎn)生單克隆抗體的工作量。為了實現(xiàn)此目標，開發(fā)了一種多靶標技術，使用對應的抗原，基于B淋巴細胞上的免疫球蛋白受體，將被多種抗原致敏的B淋巴細胞預選出來。初步結果表明，在用多種抗原免疫后，在多種致敏B淋巴細胞存在的情況下，用對應抗原進行特異性B淋巴細胞選擇時，目標抗原可以特異性地選擇每個B淋巴細胞。將多種抗原用于一只小鼠的免疫時，由于其他抗原的免疫刺激會發(fā)生免疫抑制，因此一只小鼠僅可使用3-5個抗原進行免疫。

圖5：基于多靶標技術的新一代雜交瘤技術

7.立體特異性靶向技術

立體特異性靶向技術針對抗原三級結構，產(chǎn)生特異性單克隆抗體。使用表達抗原的骨髓瘤細胞來選擇致敏B淋巴細胞，完整的細胞表面表達的抗原保留其三級結構，轉(zhuǎn)染后的骨髓瘤細胞保持高存活力。骨髓瘤細胞-（抗原）-（免疫球蛋白受體）-B淋巴細胞復合物，通過電脈沖選擇性融合。PEG也可使骨髓瘤細胞選擇的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞特異性融合。當選擇促甲狀腺激素受體作為抗原時，針對促甲狀腺激素受體的單克隆抗體能夠競爭TSH上相同的結合位點。立體特異性靶向技術所產(chǎn)生的的雜交瘤細胞效率低于通過BCT獲得的。

圖6：基于立體特異性靶向技術的新一代雜交瘤技術

醫(yī)用人單克隆抗體對靶抗原具有非常高的特異性，具有相對較長的半衰期，同時對人體產(chǎn)生的副作用較小,因而需求已急劇增加。立體特異性靶向技術可產(chǎn)生針對所需抗原三級結構的特異性單克隆抗體。立體特異性靶向和轉(zhuǎn)基因小鼠的組合對于產(chǎn)生針對靶抗原的構象特異性人單克隆抗體是明確可行的。

BCT技術、多靶標技術和立體特異性靶向技術中最重要的一步就是將抗原選擇的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞選擇性融合。施加電脈沖時，在平行排列的電極之間會形成垂直強電場。沿電場排列的B淋巴細胞-骨髓瘤復合物可以有效融合，而在任何其他方向上的復合物都不會發(fā)生電融合。目前還沒有關于細胞復合物角度的電融合效率的研究。但通過控制其方向排列，效率可以顯著提高。激光，電泳，磁力和微流控，介電電泳作為驅(qū)動力可操縱細胞的排列結構。因此，在施加電場以進行細胞融合之前使用介電電泳技術可能會顯著提高效率。另外，由于介電電泳操縱是基于交流電壓，因此可以很容易融合到細胞系統(tǒng)中。

體外免疫可以使用較低水平的、體內(nèi)有毒或不穩(wěn)定的抗原，且該過程可在3-5天內(nèi)完成。但由于免疫時間較短，B淋巴細胞的成熟程度可能不足。轉(zhuǎn)基因Immorto小鼠細胞在體外的壽命較長，可以解決這一問題。

除小鼠外，還可使用其他動物物種利用雜交瘤技術產(chǎn)生單克隆抗體。兔子等較大的動物可能具有更大的B淋巴細胞庫。免疫的兔脾細胞與含有兔轉(zhuǎn)基因的小鼠骨髓瘤細胞融合時，生成的異種雜交瘤細胞非常不穩(wěn)定。因此在降解之前，從異種雜交瘤細胞中分離編碼目標抗體的基因并轉(zhuǎn)染哺乳動物，以產(chǎn)生Kd值約為10^-14M，具極高親和力的單克隆抗體。

Masahiro Tomita, Kanta Tsumoto. Hybridoma technologies for antibody production. Immunotherapy(2011)3(3).371-380.