抗原抗體是否能維持凍融穩(wěn)定性是非常重要。因為這關系到我們的企業(yè)參考品，校準品，質控品，及產(chǎn)品性能。因此了解抗原抗體反復凍融不穩(wěn)定的原因非常重要。下面我們就直接進行主題!

一.抗原抗體凍融后不穩(wěn)定的原因是什么？

　　大家都知道抗原抗體的本質還是蛋白質，蛋白質的組成單元是氨基酸，氨基酸，一系列氨基酸經(jīng)過α螺旋和β折疊等形成了復雜的三位結構。所以結構的穩(wěn)定性對于抗原抗體的穩(wěn)定性至關重要。

　　凍融這個操作會影響蛋白質的穩(wěn)定性，主要是因為凍融過程中產(chǎn)生的冰晶和溫度變化會對蛋白質的結構造成不利影響。底層原理涉及幾個關鍵因素：

冰晶的形成

界面效應

溫度變化

重復凍融的累積效應

1. 冰晶的結構特征

　　冷凍過程中，溶液中的水分子逐漸從溶液中聚集成團，形成冰晶。冰晶的形成是由于水分子在低于其冰點時失去溶解度而形成的結晶體。

　　冰晶是有序排列的水分子網(wǎng)絡，其結構緊密而穩(wěn)定。冰晶形成時，水分子通過氫鍵相互連接，形成六角形的結構。這種結構比水在液態(tài)時分子間距離更大，密度更小，導致冰晶在形成時體積擴大，也因此表現(xiàn)出比水更輕的密度。

2. 冰晶對蛋白質的影響

濃縮效應：

冰晶形成時，溶液中的水分子逐漸凝聚到冰晶中，導致溶液中蛋白質的濃度升高。這種濃縮效應可能會增加蛋白質在溶液中的相互作用，促進蛋白質的聚集和沉淀。

界面效應

：冰晶的形成和解凍過程中，液相和固相之間的界面會發(fā)生變化。這種界面效應可能會導致蛋白質在界面上的吸附和局部變性。在冰晶解凍時，這種效應可能更為顯著，因為冰晶與溶液之間的相變過程可能引起機械應力和蛋白質分子的結構紊亂。

蛋白質的變性和失活

：蛋白質的結構和功能依賴于其特定的三維構象。冰晶的形成和解凍過程中可能引起蛋白質的部分變性或失活，特別是對于熱敏感的蛋白質而言。這種失活通常是由于蛋白質結構的局部不穩(wěn)定性增加，導致活性位點或功能結構的損傷。

3. 溫度變化

　　凍融過程中，溫度的劇烈變化會對蛋白質的結構和功能產(chǎn)生直接影響。快速的凍結和解凍過程可能導致蛋白質局部結構的失衡和變性，尤其是對于熱敏感的蛋白質而言。

4.重復凍融的累積效應

　　多次循環(huán)凍融會導致這些影響的累積，加劇蛋白質的損傷和失活。每次凍融過程中可能發(fā)生的微小結構變化和損傷，隨著時間的推移可能積累到足以顯著影響蛋白質的整體穩(wěn)定性和活性。

二.如何解決抗原抗體凍融后的不穩(wěn)定現(xiàn)象？

　　既然是冰晶的形成對蛋白質穩(wěn)定性不利，那么解決抗原抗體等蛋白凍融不穩(wěn)定的思路是減少冰晶的形成對蛋白質的不利影響。

可添加的保護劑如下：

1）甘油：

甘油可以降低溶液的冰點，減少冰晶在冷凍過程中形成。同時甘油是一種小分子保護劑，可以通過與蛋白質表面的水分子競爭結合，穩(wěn)定蛋白質的結構，減少冷凍過程中的變性。

2）蔗糖或海藻糖：

蔗糖在冷凍過程中可以形成玻璃態(tài)(玻璃化轉變)，這種無定形的固態(tài)可以包裹和穩(wěn)定蛋白質，防止冰晶對蛋白質結構的損傷。并且蔗糖能夠形成一個水化層，保護蛋白質表面，減少冷凍和凍融過程中由于脫水導致的變性。

3）甘氨酸：

甘氨酸可以降低溶液的冰點，從而減緩冰晶的形成。同時具有良好的水合能力，可以與蛋白質分子形成穩(wěn)定的水合作用，防止蛋白質在凍融過程中由于水分流失而變性。甘氨酸作為一種兼容溶質，在高濃度下可以保持蛋白質的天然結構，同時不干擾蛋白質的功能，也可以提高溶液的玻璃態(tài)轉變溫度(Tg)，在高于Tg的溫度下，溶液保持玻璃態(tài)，可以減少冰晶的形成，從而保護蛋白質結構。

4）聚乙二醇：

PEG 是一種大分子保護劑，通過提供空間位阻，防止蛋白質分子聚集。這種效應可以減少冷凍和凍融過程中由于蛋白質聚集導致的失活。PEG 可以增加溶液的粘度，減少蛋白質分子的運動，從而穩(wěn)定蛋白質的結構。它還可以通過與蛋白質表面水分子的相互作用，保持蛋白質的水合狀態(tài)，防止變性。

5）2-甲基2,4-戊二醇（MPD）：

MPD可以干擾冰晶的生長過程，使冰晶形成的速度變慢并減少冰晶的大小。還可以通過與蛋白質分子上的極性基團(如氨基和羧基)形成氫鍵，穩(wěn)定蛋白質的二級和三級結構。

6）牛血清白蛋白（BSA）:

BSA作為一種穩(wěn)定劑，可以通過與其他蛋白質分子形成非共價鍵，防止它們在凍融過程中變性和聚集。BSA能夠覆蓋蛋白質的表面，提供一個保護性屏障，減少外界環(huán)境對蛋白質結構的破壞。

　　在凍融過程中，蛋白質分子可能會因為表面吸附而失活。BSA可以通過競爭性吸附作用，防止其他蛋白質分子在容器壁或冰晶表面上的吸附，從而保護它們的活性。