摘要：本研究為了檢測慶大霉素在動物組織中的殘留，制備了單克隆抗體(Mab)，并建立了敏感的間接競爭化學發(fā)光酶免疫分析法(icCLEIA)。首先將慶大霉素與牛血清白蛋白結合作為免疫原，免疫BALB/c小鼠。然后采用雜交瘤技術制備抗慶大霉素單抗。最后，建立了對慶大霉素具有50%抑制濃度(IC₅₀)為0.067 ng/mL的icCLEIA。icCLEIA的檢測限為0.002 ng/mL。單抗與結構類似物的交叉反應性<0.01%。慶大霉素在豬肉和魚類樣品中的加樣回收率為80 ~ 101%，變異系數(shù)<6.4%。樣品采用UPLC-MS/MS檢測，以評估icCLEIA的可靠性。結果表明，制備的抗慶大霉素單抗可用于動物組織中慶大霉素殘留的快速、便捷的免疫檢測。

【內(nèi)容介紹】

1、抗原的制備

采用碳二亞胺偶聯(lián)法合成法，將載體蛋白(BSA或OVA) 10 mg溶解于2ml PBS (0.01 M, pH 7.4)中，然后加入EDC (6 mg)和NHS (10 mg)，在25°C下溫和攪拌0.5 h，然后將溶解于1ml PBS中的慶大霉素(10 mg)滴入上述溶液中。在25℃下攪拌3小時，在0.01 M PBS (pH 7.4)下透析3天。然后將溶液分裝并儲存在－20℃;采用BSA -慶大霉素偶聯(lián)物免疫，OVA -慶大霉素包被抗原。最后，用金免疫層析法(GICA)對兩種偶聯(lián)物進行表征，以確定慶大霉素是否成功偶聯(lián)到BSA和OVA載體蛋白上。

2、慶大霉素單克隆抗體的制備

第一次免疫時，在FCA中乳化BSA -慶大霉素，7只8周齡BALB/c雌性小鼠(每只小鼠)皮下多點免疫，劑量為150µg。4周后，每3周給小鼠注射50µg乳化液中的BSA -慶大霉素，直至第5次免疫。第三次強化免疫7天后，從小鼠尾部抽血獲得抗血清。通過間接ELISA檢測抗血清的抗體滴度，并通過間接競爭性ELISA檢測抗體選擇性。第四次免疫后，選擇血清稀釋度高且對慶大霉素檢測靈敏度高的小鼠進行細胞融合。細胞融合實驗前4天，將100-200µg慶大霉素- BSA加入PBS (0.01 M, pH 7.4)腹腔注射。用聚乙二醇(PEG1450)將小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合。融合后，將融合后的細胞置于96孔細胞培養(yǎng)板中，在HAT培養(yǎng)基中增殖。在細胞融合后7-10天，通過間接競爭ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，并通過極限稀釋法進行亞克隆。

3、icCLEIA的發(fā)展與優(yōu)化

棋盤法檢測包被抗原濃度和抗慶大霉素單抗稀釋倍數(shù)。優(yōu)化免疫反應時間、二抗稀釋度、二抗反應時間和發(fā)光檢測時間，提高檢測靈敏度。在優(yōu)化條件下對icCLEIA的靈敏度進行評價。x軸為慶大霉素濃度的對數(shù)，B/B₀ (B)為慶大霉素指示濃度下的平均RLU;B₀為慶大霉素零濃度時的平均RLU。按照B/B₀ - logC繪制慶大霉素標準曲線，并通過Origin8.5計算慶大霉素標準曲線的檢出限(LOD)、IC₅₀和線性范圍(IC₂₀-IC₈₀)。結果如圖1所示。

圖1所示。不同工作條件對icCLEIA敏感性的影響(n = 3). A:競爭性免疫反應時間;B:二抗孵育時間;C:二抗稀釋倍數(shù);D: RLU值檢測時間。

4、交叉反應性

圖2所示。慶大霉素icCLEIA標準曲線(n = 3)

圖3所示。抗慶大霉素單抗與慶大霉素類似物的交叉反應性

5、icCLEIA的恢復及其與UPLC-MS/MS分析的相關性

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對本地市場的豬肉和魚類樣品進行了陰性檢測。陰性樣品分別加入0、0.375、0.75、1.5 μg濃度的慶大霉素。由于豬肉和魚類樣品中含有多種蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，在樣品預處理時采用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，正己烷提取脂質(zhì)。樣品提取后，采用icCLEIA和UPLC-MS/MS對提取物進行分析。為了減少樣品成分的潛在干擾，提取液在分析前用PBST適當稀釋。在豬肉樣品中，icCLEIA法對慶大霉素的平均加樣回收率為81% ～ 101%，變異系數(shù)為3.7% ～ 6.4%;UPLC-MS/MS法對慶大霉素的平均加樣回收率為96% ～ 106%，變異系數(shù)為0.2% ～ 5.1%。在魚類樣品中，icCLEIA的平均回收率為80% ～ 100%，CV值為0.8% ～ 6.3%;UPLC-MS/MS的平均回收率為100% ～ 105%，CV值為0.8% ～ 3.2%。結果表明，該方法可作為動物食品中慶大霉素殘留快速、高效的篩選方法。

【結論】

本研究將慶大霉素半抗原與牛血清白蛋白(BSA)和卵細胞(OVA)結合制備免疫原和包被抗原，通過免疫小鼠和細胞融合實驗獲得了幾個高親和力的抗慶大霉素陽性雜交瘤細胞。以特異性雜交瘤陽性細胞40H6為原料制備腹水單克隆抗體，經(jīng)親和層析純化。以純化腹水單抗為基礎，建立了用于慶大霉素動物組織檢測的高靈敏度icCLEIA, IC₅₀為0.067 ng/mL, LOD為0.002 ng/mL，與結構類似物的交叉反應性<0.01%。慶大霉素在豬肉和魚類樣品中的回收率為80 ～ 101%，變異系數(shù)小于6.4%。與以往報道的慶大霉素檢測方法相比，本研究開發(fā)的icCLEIA具有更高的靈敏度和特異性。通過與UPLC-MS/MS的比較，驗證了icCLEIA方法的可靠性和準確性。因此，本研究建立的icCLEIA方法可作為常規(guī)篩選慶大霉素在動物性食品中殘留的有力工具。