小分子量蛋白該如何做好WB？
發(fā)布時(shí)間：2023-09-11 15:28:42來(lái)源：
有些蛋白指標(biāo)一次就能做成功，而有些指標(biāo)做無(wú)數(shù)次都是失敗。蛋白分子量過(guò)大或過(guò)小都不易做，今天我們就來(lái)聊下小分子量蛋白如果成功做出WB！
一、上樣量
通常Western Blot每孔上樣量為30-50μg，80%蛋白在細(xì)胞中的含量很低，當(dāng)?shù)鞍追肿恿窟^(guò)小時(shí)，上樣量建議選擇50-100μg。畢竟對(duì) 于小分子的蛋白來(lái)說(shuō)，在跑電泳時(shí)，稍不留心，蛋白就跑沒(méi)影了。
二、凝膠電泳
1.選擇合適膠濃度。分子量小的蛋白，建議配置5%的濃縮膠，分離膠濃度參考下表。
| 分子量（kDa) | 分離膠濃度 |
| X≤10 | 15% |
| 10<X≤15 | 13.5% |
| 15<X≤25 | 12% |
2.電泳電壓太大會(huì)導(dǎo)致跑在最前面的小分子蛋白成鋸齒狀，建議濃縮膠用80V 30分鐘，之后調(diào)成100V, 溴酚藍(lán)跑到距膠底1cm以上就停下，不要跑到底，否則目的蛋白可能跑出去了。
三、轉(zhuǎn)模
.膜的選擇
1。免疫印跡中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF 膜等。推薦選用 PVDF 膜(聚偏二氟乙烯)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與 PVDF 膜以疏水力結(jié)合，從而將親水部位暴露到液相，使抗體更容易與之結(jié)合。
針對(duì)不同分子量的蛋白質(zhì)，PVDF 膜有兩種規(guī)格：0.45 μm 的膜適合檢測(cè) MW > 20 kDa 的蛋白質(zhì)，0.2 μm 的膜適合檢測(cè)MW < 20 kDa 的蛋白質(zhì)，而且0.2 μm 的膜可以有效防止蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移過(guò)程中直接穿透過(guò)膜。PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中，PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。
轉(zhuǎn)膜方式
2.。對(duì)于小分子蛋白，電流太大或時(shí)間太長(zhǎng)容易轉(zhuǎn)過(guò)。轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)，條件參考下圖
| 分子量（kDa) | 轉(zhuǎn)膜條件 |
| X≤10 | 恒流200mA,30min |
| 10 < X≤15 | 恒流200mA,40min |
| 15< X≤20 | 恒流200mA,50min |
3.轉(zhuǎn)膜前的平衡時(shí)間短點(diǎn)，幾分鐘甚至1min就好。平衡所用的液體及轉(zhuǎn)膜液成份相同，都不要加SDS，效果是天壤之別。
四、轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色，測(cè)定蛋白豐度。
PVDF膜經(jīng)麗春紅染色后，可以檢測(cè)出樣品電泳過(guò)程中呈現(xiàn)印跡的大小，通過(guò)各個(gè)泳道上樣品印跡的對(duì)比，可以初步判斷上樣量的準(zhǔn)確性。
五、一抗的稀釋比例。
通常抗體的說(shuō)明書上都會(huì)給出一定的稀釋比例對(duì)于分子量過(guò)小的蛋白來(lái)說(shuō)，一抗應(yīng)選擇低的稀釋比例，這樣有助于抗體的結(jié)合。
六、顯影要把握曝光時(shí)間。
根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，如果在暗處馬上可以看到條帶，建議曝光時(shí)間在30s-2min內(nèi)完成，如果信號(hào)較弱，第一遍滴加顯影液后條帶不會(huì)很清晰，可以把膜拿出來(lái)放一邊讓它反應(yīng)一會(huì)，然后再放回機(jī)器里面，重新滴加顯影液顯影，效果就會(huì)好不少。還有適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間，就能獲得清晰的條帶。
以上就是關(guān)于小分子量蛋白WB實(shí)驗(yàn)的一些經(jīng)驗(yàn)建議，希望對(duì)還被小分子量蛋白WB折磨的朋友們有幫助。
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