摘要：

　　基因工程技術(shù)可充分利用抗體天然結(jié)構(gòu)，徹底改變了免疫學(xué)。單鏈抗體(scFv)是基于重組抗體技術(shù)的典型生物制劑。scFv是通過(guò)短柔性肽linker將重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因連接成單個(gè)轉(zhuǎn)錄本，從細(xì)胞和合成文庫(kù)中生成的片段。scFv分子的特異性和親和力與親本抗體大多數(shù)情況下相當(dāng)。與標(biāo)記蛋白和其他分子融合可提高其穩(wěn)定性、循環(huán)半衰期、活性和純化效率。本文還介紹了包括scFv的構(gòu)建方案、治療和診斷應(yīng)用以及相關(guān)的挑戰(zhàn)。

　　1.引言

　　單克隆抗體(mAb)具有表位特異性，因此可以對(duì)它們進(jìn)行重組調(diào)整，以靶向參與潛在病理狀況的特定分子。這一特性使mAb在解決與其相關(guān)的治療和診斷限制方面，與多克隆抗體不同。此外，mAb可以通過(guò)嵌合或人源化雜交瘤制備，并且可以識(shí)別人類(lèi)表位，克服了免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。人源化抗體已成功用于治療多種人類(lèi)疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病和幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，mAb仍然不足以針對(duì)所有靶標(biāo)，因?yàn)槟承┛乖肿优c特定病理環(huán)境有關(guān)，具有非常隱蔽的性質(zhì)。此外，mAb對(duì)實(shí)體瘤的滲透及其瘤內(nèi)分布受到限制。這影響了它們?cè)诜肿映上窈椭委燁I(lǐng)域的應(yīng)用效力。因此，研究人員開(kāi)始尋找替代的抗體設(shè)計(jì)形式。重組抗體技術(shù)能夠生產(chǎn)具有不同修飾特征的抗體，對(duì)其他生物分子具有高親和力和特異性。

　　重組抗體片段是目前最熱門(mén)的研究領(lǐng)域，與全長(zhǎng)mAb相比，重組抗體片段具有不同的特性。與傳統(tǒng)抗體相比，通過(guò)抗體工程、分子克隆甚至酶技術(shù)，可以更經(jīng)濟(jì)、更直接地生產(chǎn)片段分子。與以前的技術(shù)方案不同，這種新范式為新的治療學(xué)科創(chuàng)造了一個(gè)平臺(tái)，能夠靶向與特定病理疾病有關(guān)的分子。目前存在幾種抗體片段，最著名的是單鏈抗體(又稱(chēng)單鏈可變片段，scFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體、抗原結(jié)合片段(Fab)和可結(jié)晶片段(Fc)結(jié)構(gòu)域。scFv Ab 包括可變重(VH)和可變輕(VL)鏈，具有較小的尺寸，可以從各種文庫(kù)中獲得。它可以被設(shè)計(jì)成更大的多聚體形式，如雙特異性、三價(jià)雙特異性、四價(jià)雙特異性抗體衍生物和偶聯(lián)形式，適用于多種應(yīng)用。本文討論了scFv的研究進(jìn)展和在治療和診斷中發(fā)揮的作用。

　　2.1. scFv的設(shè)計(jì)變體

　　scFv 由可變區(qū)(包括重鏈和輕鏈)的基因生產(chǎn)，這些基因通過(guò)短柔性linker肽在基因上構(gòu)建在單個(gè)轉(zhuǎn)錄本中(圖1a)。其通常能夠以與親本抗體相同的特異性和親和力結(jié)合靶抗原。其平均分子量為 27 kDa，被公認(rèn)為是具有 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域的所有抗體片段中最小的功能性免疫球蛋白單元。VH-linker-VL和VL-linker-VH排列都可以產(chǎn)生有用的scFv，但在某些情況下，scFv在一種構(gòu)象中的表現(xiàn)優(yōu)于另一種構(gòu)象。

　　linker肽的長(zhǎng)度和序列在確定scFv抗體的結(jié)合特性、特異性、折疊和溶解度方面起著重要作用。linker大多在15-20個(gè)氨基酸序列內(nèi)，富含甘氨酸和絲氨酸殘基，也可以優(yōu)化到多達(dá)35個(gè)氨基酸。linker在兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的羧基和氨基末端之間的距離為3.5nm(35 Å)。富含甘氨酸-絲氨酸的linker序列因其柔韌性而最常用。不過(guò)體外研究表明，linker中的重復(fù)序列在基于PCR的實(shí)驗(yàn)中存在問(wèn)題，似乎具有免疫原性，并且與非重復(fù)linker相比，穩(wěn)定性較差。此外，絲氨酸，特別是和其他帶電殘基，如谷氨酸和賴氨酸，如果包含在linker序列中可以提高scFv的剛性和溶解度。

　　通過(guò)設(shè)計(jì)不同的linker，可產(chǎn)生各種形式的多聚體，如二聚體、三聚體和雙特異性抗體。關(guān)于linker序列設(shè)計(jì)，最初由Huston等設(shè)計(jì)使用的15-聚體(G4S)3，是五肽GGGGS的多聚體。此后，(G4S)n接頭氨基酸序列基序用作基本支架，其中18-聚體GGSSRSSSGGGGSGGGGG和20-聚體(G4S)4是一些常用的多聚體。

　　根據(jù)所采用的 scFv 抗體和linker肽的數(shù)量，生成了基于 scFv 的不同形式的抗體結(jié)構(gòu)。例如，串聯(lián) scFv 通過(guò) NH2-VL1-VH1-(linker-VL2-VH2)n-COOH 構(gòu)型中的螺旋肽linker在單個(gè)轉(zhuǎn)錄本中連接兩個(gè)或多個(gè) scFv。這些結(jié)構(gòu)生成具有雙價(jià)和/或雙特異性結(jié)合位點(diǎn)的生物制劑，可以以更大的親和力靶向特定抗原，或同時(shí)靶向兩個(gè)不同的抗原(圖1b和1c)。

　　scFv抗體可以通過(guò)多聚化技術(shù)進(jìn)一步修飾，增加其分子量、親和力和靈敏度。也可以通過(guò)來(lái)自兩種不同抗體分子的兩條不同鏈的相互作用來(lái)修飾，稱(chēng)為二價(jià)二聚體(diabody，圖1d)。其中一種形式稱(chēng)為雙親和重靶向蛋白(DART)，使用兩條不同的鏈生成雙特異性二價(jià)二聚體，其中第一條鏈包含來(lái)自抗體 1 的 VH 和來(lái)自抗體 2 的 VL，第二條鏈包含來(lái)自抗體 2 的 VH 和來(lái)自抗體 1 的 VL(圖 1e)。然后在兩種多肽之間添加鏈間二硫鍵，提高分子的穩(wěn)定性，降低同型二聚體的聚集程度。此外，通過(guò)在一條鏈中連接三個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，可以以類(lèi)似于二元體的方式產(chǎn)生三價(jià)、四價(jià)(圖1f)或五價(jià)結(jié)構(gòu)。

　　圖1 scFv抗體及其他scFv形式的示意圖。

　　(a) scFv抗體：VH的C末端通過(guò)一個(gè)富含甘氨酸和絲氨酸殘基的靈活肽鏈連接到VL的N末端。

　　(b) 由兩個(gè)相同的scFv構(gòu)成的二價(jià)單特異性串聯(lián)scFv，通過(guò)螺旋鏈連接。

　　(c) 由兩個(gè)不同的scFv構(gòu)成的二價(jià)雙特異性scFv，通過(guò)螺旋鏈連接。

　　(d) 雙特異性scFv形式由兩個(gè)分開(kāi)的鏈組成，每個(gè)鏈包含來(lái)自不同抗體的VL和VH，以頭尾排列。

　　(e) 雙特異性雙DART®形式scFv由兩個(gè)不同的多肽鏈組成，通過(guò)非共價(jià)鍵和二硫鍵的相互作用連接在一起。

　　(f) 四價(jià)雙特異性分子(TandAb)由兩個(gè)diabody以線性排列連接構(gòu)成。

　　2.2. scFv抗體的優(yōu)點(diǎn)

　　與全長(zhǎng)單克隆抗體相比，scFv 抗體具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)，包括其固有特性，如大小、免疫原性效應(yīng)、表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)。

　　(1)scFv 抗體的尺寸較小(Mwt為27 kDa)，即比完全抗體(150 kDa)小五分之一，因此易于穿透腫瘤組織并到達(dá)隱秘表位。

　　(2)由于其體積小，其從血液和非靶組織中的快速清除能力得到了增強(qiáng)。

　　(3)scFv抗體分子可以在微生物表達(dá)系統(tǒng)中輕松生產(chǎn)和操作，該系統(tǒng)可以在短時(shí)間內(nèi)以較低的成本產(chǎn)生更高的劑量。

　　(4)scFv 的免疫原性較弱，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈せ羁贵w效應(yīng)器功能的 Fc 結(jié)構(gòu)域。

　　(5)scFv具有與親本抗體相同的抗原結(jié)合能力，甚至可以與其他潛在分子偶聯(lián)，以提高其活性、穩(wěn)定性和親和力，從而更傾向于結(jié)合靶分子。

　　2.3. scFv抗體的產(chǎn)生

　　產(chǎn)生scFv抗體的基本方案如下所示(圖2)。

　　圖2 制備scFv抗體的基本程序。從重排的可變基因片段中獲得的抗體庫(kù)可以來(lái)源于原始B細(xì)胞、激活的B細(xì)胞和通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬獲得的合成庫(kù)。經(jīng)過(guò)mRNA富集后，使用PCR組裝scFv庫(kù)，并將其克隆入噬菌體載體中，從而在噬菌體表面表達(dá)scFv庫(kù)。將噬菌體庫(kù)與目標(biāo)配體孵育后，進(jìn)行洗滌步驟以去除所有未結(jié)合的噬菌體。所有結(jié)合的噬菌體被洗脫并在大腸桿菌中擴(kuò)增，這些噬菌體可用于進(jìn)一步的篩選，以獲取特異性結(jié)合子。

　　2.3.1. mRNA的分離和VH和VL基因的PCR擴(kuò)增

　　目前，由免疫文庫(kù)和通用文庫(kù)組成的幾種細(xì)胞和合成抗體文庫(kù)已被用作生成多種抗體形式的來(lái)源(圖2)。免疫文庫(kù)是從免疫動(dòng)物或人類(lèi)組織或血液(如骨髓、外周血單核細(xì)胞(PBMC)、脾臟、雜交瘤細(xì)胞系和任何細(xì)胞成分的樣本中產(chǎn)生的。通用庫(kù)分為天然庫(kù)、合成庫(kù)和半合成庫(kù)。天然文庫(kù)來(lái)源于未免疫供體的重組Ig V基因，具有組合性質(zhì)，在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，重鏈和輕鏈隨機(jī)組合。合成文庫(kù)是利用分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)的，目的是增強(qiáng)重組抗體。半合成文庫(kù)通常來(lái)源于天然抗體和合成抗體序列的組合。

　　對(duì)于免疫和非免疫供體，通過(guò)分離總 RNA產(chǎn)生編碼 VH 和 VL 抗體結(jié)構(gòu)域的基因片段。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA，cDNA被用作相關(guān)基因PCR擴(kuò)增的模板(圖2)。使用正向和反向引物，擴(kuò)增 cDNA 片段可創(chuàng)建一個(gè)包含各種 VH 和 VL 抗體基因的龐大文庫(kù)。

　　2.3.2. 接頭肽的引入和全長(zhǎng)scFv結(jié)構(gòu)域的克隆

　　linker編碼一個(gè)15肽(Gly4Ser)3，該肽位于VH和VL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間。首先，linker分別添加在每個(gè)可變區(qū)的前后，然后使用重疊延伸PCR(SOE-PCR)的兩步法進(jìn)行組裝。在組裝PCR中，VH和VL區(qū)域應(yīng)以等量存在，但可以降低linker引物的濃度，以防止某一域的優(yōu)先擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，隨后將適當(dāng)?shù)钠嗡腿y(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。生成完整的scFv，其方向可能為VH-(Gly4Ser)3-VL或VL-(Gly4Ser)3-VH，并通過(guò)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行克隆。

　　2.3.3.載體克隆、噬菌體展示和轉(zhuǎn)化

　　編碼scFv抗體的基因插入到噬菌體內(nèi)，并連接到DNA的C末端區(qū)域，而展示的肽則附著在基因的外部N末端。用于噬菌體展示的噬菌體有幾種，但最常用的是絲狀噬菌體M13，還有其他噬菌體，如Lambda、T4和T7也被使用。M13對(duì)宿主細(xì)菌無(wú)裂解作用，并通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜分泌產(chǎn)生噬菌體顆粒。M13擁有兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白用于抗體片段的表達(dá)：基因III和VIII。由于表面展示的肽拷貝數(shù)較少，基因III蛋白被廣泛使用。

　　按照相關(guān)PCR的標(biāo)準(zhǔn)方案，將scFv抗體編碼片段與噬菌體外殼蛋白基因融合。然后，將線性PCR產(chǎn)物擴(kuò)增并環(huán)化，再通過(guò)電穿孔或化學(xué)誘導(dǎo)的感受態(tài)轉(zhuǎn)化到E. coli細(xì)胞(如XL1-Blue、TG1和ER2537)中(圖2)。為了釋放包含所需片段的克隆載體，感受態(tài)細(xì)菌會(huì)感染輔助噬菌體，如VCSM13、M13KO7等。E. coli隨后會(huì)生產(chǎn)大量展示各種肽序列的噬菌體，通常大小為10^6到10^11，具體取決于所研究的文庫(kù)類(lèi)型。從中構(gòu)建并篩選抗體可變區(qū)文庫(kù)，以尋找對(duì)特定分子(如酶、抗體和目標(biāo)細(xì)胞的表面受體)具有高親和力的肽。這些體外篩選過(guò)程稱(chēng)為生物淘選(biopanning)。通過(guò)這個(gè)過(guò)程，可以確定小片段抗體對(duì)目標(biāo)抗原的結(jié)合力、親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。

　　淘選步驟包括：將展示文庫(kù)與固定在固體支持物(如珠子、膜等)上的配體進(jìn)行孵育;通過(guò)洗滌緩沖液去除未結(jié)合的噬菌體;洗脫結(jié)合的噬菌體;并將其重新感染E. coli細(xì)胞(圖3)。最終，會(huì)生成一個(gè)每個(gè)噬菌體表面上都表現(xiàn)出單一抗體片段的噬菌體文庫(kù)。通常會(huì)使用多輪結(jié)合(大多數(shù)情況下四到六輪)和擴(kuò)增來(lái)選擇展示抗體片段并緊密結(jié)合目標(biāo)分子的抗原特異性噬菌體克隆。最后，通過(guò)DNA測(cè)序?qū)γ總€(gè)克隆進(jìn)行標(biāo)記，以揭示它們不同的CDR(互補(bǔ)決定區(qū))。

　　圖3 噬菌體展示篩選示意圖。將編碼目標(biāo)scFv的基因片段與噬菌體外殼蛋白編碼基因融合。展示scFv抗體的噬菌體文庫(kù)通過(guò)與抗原(以其天然形式存在)孵育進(jìn)行親和力選擇，抗原可以固定在磁珠或固體表面上。所有未結(jié)合的噬菌體(或弱結(jié)合)通過(guò)洗滌去除，而牢固結(jié)合的噬菌體則通過(guò)改變pH條件回收。E. coli細(xì)胞與輔助噬菌體共同感染釋放新噬菌體顆粒，用于隨后的篩選周期，這些周期通常包括3到4輪。最后，通過(guò)噬菌體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(phage ELISA)對(duì)結(jié)合物進(jìn)行富集，并隨后回收所需的scFv抗體。

　　2.3.4. scFv抗體的表達(dá)

　　展示技術(shù)有助于在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中快速篩選多個(gè)抗體片段，并產(chǎn)生具有高特異性的純抗體分子。小片段分子已使用多種表達(dá)系統(tǒng)成功展示，包括真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(基于酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)、原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(基于細(xì)菌細(xì)胞)和無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(核糖體展示)。

　　(1)原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。因?yàn)樵思?xì)胞表達(dá)系統(tǒng)價(jià)格低廉，并且可以在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中快速生長(zhǎng)。因此，可以在生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生高生物質(zhì)和蛋白質(zhì)產(chǎn)品。使用最廣泛的可能是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其基因組簡(jiǎn)單且易于分析，表達(dá)產(chǎn)量較高。但表達(dá)的蛋白產(chǎn)物缺乏翻譯后修飾和正確的折疊，因此，需要通過(guò)各種變性劑進(jìn)行額外的增溶，并在純化后進(jìn)行進(jìn)一步的體外復(fù)性步驟。

　　(2)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。對(duì)于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，最常用的菌株是來(lái)自真菌界的單細(xì)胞酵母，包括畢赤酵母(Pichia pastoris)和啤酒酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。它們?cè)谂囵B(yǎng)中生長(zhǎng)得速度快，并且能提供比任何其他表達(dá)平臺(tái)(如桿狀病毒和哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng))更高的表達(dá)水平。它們還具有真核細(xì)胞的許多優(yōu)點(diǎn)，包括蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾。

　　(3)無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：核糖體展示技術(shù)。

　　基于表型與基因型固有關(guān)聯(lián)性，針對(duì)目標(biāo)配體篩選有效抗體的體外選擇方案。其主要目的是解決細(xì)胞和噬菌體展示方法的缺陷，通過(guò)體外生成三元蛋白-核糖體-mRNA復(fù)合物。在選擇過(guò)程中，mRNA-蛋白復(fù)合物會(huì)結(jié)合到固定的配體上，從而暴露復(fù)合物中的mRNA，進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA序列，最終通過(guò)PCR擴(kuò)增。隨后，通過(guò)3-5輪篩選獲得特定的抗體片段(圖4)。特定產(chǎn)物的DNA編碼文庫(kù)被連接到一個(gè)由終止密碼子阻斷的間隔序列上。在體外翻譯過(guò)程中，間隔序列與肽基tRNA連接，占據(jù)核糖體的軸。這樣，正確折疊的目標(biāo)蛋白會(huì)從核糖體復(fù)合物中突出，結(jié)合到固體表面上的固定配體上。常用的表面材料包括硝酸纖維素、柱狀基質(zhì)、磁珠、聚苯乙烯管和96孔微量滴定板。在洗滌步驟中，所有未結(jié)合的復(fù)合物會(huì)被清除。而結(jié)合的復(fù)合物中的mRNA通過(guò)原位RT-PCR被回收。最終，通過(guò)ELISA確認(rèn)所有識(shí)別的抗體克隆，并在必要時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行體外親和力成熟步驟，以提高小片段分子的穩(wěn)定性和/或親和力。然后，對(duì)個(gè)體結(jié)合劑進(jìn)行測(cè)序和進(jìn)一步的生化特征分析。這些方法有效地篩選出大量編碼DNA文庫(kù)，選擇高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)闆](méi)有細(xì)胞培養(yǎng)的參與，與其他受轉(zhuǎn)化效率和翻譯后修飾限制的展示技術(shù)相比更加高效。

　　圖4 體外核糖體展示示意圖。首先，免疫供體生成感興趣的scFv抗體的DNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)mRNA富集處理以獲得VH和VL片段的文庫(kù)后，通過(guò)體外翻譯生成含有目標(biāo)生物體的三元蛋白–核糖體–mRNA復(fù)合物。該復(fù)合物通過(guò)結(jié)合目標(biāo)配體進(jìn)行選擇。接下來(lái)，回收scFv的DNA文庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，以便進(jìn)行進(jìn)一步的選擇循環(huán)或后續(xù)分析。因此，DNA文庫(kù)可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄與翻譯耦合的方法一次或多次擴(kuò)增，形成mRNA、相關(guān)的生物體以及核糖體復(fù)合物(PRM復(fù)合物)，該復(fù)合物通過(guò)與固相上的抗原結(jié)合進(jìn)行選擇。

　　2.3.5. scFv抗體的純化

　　在其生產(chǎn)周期和表達(dá)系統(tǒng)中，抗體片段可能會(huì)被雜質(zhì)污染，包括內(nèi)毒素、內(nèi)源性病毒、宿主細(xì)胞蛋白、DNA 和其他聚集體，這些物質(zhì)應(yīng)通過(guò)有效的純化方法去除。用硫酸銨、聚乙二醇、依沙吖啶和辛酸處理的初步步驟可用于增加抗體片段的濃度。然而，沉淀的純度、選擇性、重現(xiàn)性和產(chǎn)量會(huì)受到多種因素的影響，如溫度、時(shí)間、pH 值和鹽化速率。用于表達(dá)的細(xì)菌菌株也會(huì)影響細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵的形成。

　　表達(dá)系統(tǒng)的差異也使片段分子需要經(jīng)過(guò)不同的純化步驟。因此，在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的抗體片段首先通過(guò)裂解細(xì)胞而釋放，用不同的去污劑溶解，然后重新折疊至其適當(dāng)?shù)臉?gòu)象，這與通過(guò)細(xì)菌包膜從周質(zhì)空間分泌的抗體片段不同。此外，抗體可以根據(jù)其一般的、可預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)、大小和化學(xué)性質(zhì)，以及對(duì)特定類(lèi)別抗體(如 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE)具有更強(qiáng)親和力的蛋白質(zhì)的相互作用以及由它們衍生的片段結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離。建議采用多模式純化方法，通過(guò)各種層析平臺(tái)相互結(jié)合、與親和標(biāo)簽偶聯(lián)以及非層析方法，以獲得所需應(yīng)用的高純度抗體片段。

　　3. scFv抗體的應(yīng)用

　　目前，基于scfv抗體的免疫療法和診斷在腫瘤學(xué)、自身免疫性疾病、神經(jīng)病變、慢性炎癥性疾病和各種傳染病中受到高度重視。scfv也可用于食品危害因子檢測(cè)，例如抗生素、毒素、過(guò)敏原、非法添加劑、殺蟲(chóng)劑和化學(xué)品等。

　　3.1. 治療

　　目前有近 1,200 種治療性抗體處于臨床試驗(yàn)階段。其中約175例正在接受監(jiān)管審查，約140例正在接受關(guān)鍵的2期、2/3期或3期臨床試驗(yàn)(稱(chēng)為“late-stage”)的評(píng)估。此外，預(yù)計(jì)將有700多個(gè)mAb用于臨床前和臨床開(kāi)發(fā)。根據(jù)美國(guó)食品和藥物管理局(US FDA)的數(shù)據(jù)，這些mAb中有106種被批準(zhǔn)用于癌癥治療。由于缺乏 FcR，傳統(tǒng)mAb募集 T 細(xì)胞的能力有限。因此，大多數(shù)基于 scFv 的形式被設(shè)計(jì)為多特異性，以實(shí)現(xiàn)將 T 細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (CD3+) 與特定腫瘤抗原家族相連的潛力。所有雙特異性形式都具有高于單價(jià)片段的親和力和特異性。由于其尺寸微小，scFv抗體主要與其他分子偶聯(lián)，以產(chǎn)生具有高親和力和特異性的蛋白質(zhì)，用于靶向治療和揭示幾種疾病病理，如癌癥、自身免疫綜合征、神經(jīng)退行性疾病等。

　　3.2分子生物成像

　　基于scFv的分子生物成像可以改善現(xiàn)代治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的診斷和治療應(yīng)用。在大多數(shù)情況下，傳統(tǒng)的成像方法不是靶向的，在檢測(cè)疾病階段時(shí)靈敏度較低，可能會(huì)誤導(dǎo)醫(yī)生的決策。但基于 scFv 抗體的成像是針對(duì)確定的抗原的，因此可以快速診斷病理狀態(tài)，并且由于它們從血液中快速清除，可以被用作成像探針。如果scfv被設(shè)計(jì)為通過(guò)與熒光蛋白或酶融合來(lái)產(chǎn)生靈敏的檢測(cè)探針，它們將成為診斷耐藥病原體和相關(guān)生物膜的良好替代品。

　　3.3食品中危害因子的檢測(cè)

　　免疫分析是現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的常用方法。在免疫傳感分析中，特異性抗體被用作傳感器材料表面的生物識(shí)別元件，以便能夠檢測(cè)這些危害因子。當(dāng)前已有研究應(yīng)用scfv開(kāi)發(fā)快速免疫分析方法，例如scFv 與 IC-ELISA 的結(jié)合是可靠的方法之一，可以輕松檢測(cè)抗菌劑。例如，通過(guò)噬菌體展示和定向進(jìn)化成功構(gòu)建了針對(duì)環(huán)丙沙星的scFv(CIP)。同樣，針對(duì)抗生素諾氟沙星的scFv和針對(duì)氨芐青霉素的scFv作為堿性磷酸酶融合蛋白有效地從雜交瘤細(xì)胞中構(gòu)建出來(lái)。此外，基于 scFv 的雜交基因，可以同時(shí)檢測(cè)三種抗生素，包括氯霉素 (CAP)、環(huán)丙沙星 (CPFX) 和磺胺嘧啶 (SM2)。另一種設(shè)計(jì)的scFv抗體也固定在羧酸磁珠表面，以高靈敏度和特異性有效捕獲雞肌肉中的馬杜拉霉素抗生素殘留。

　　4. scFv抗體的挑戰(zhàn)和局限性

　　4.1 scfv抗體自身的局限性

　　(1)scFv 抗體中缺少 Fc 結(jié)構(gòu)域使得該分子的熱穩(wěn)定性不如親本 mAb，而缺乏 Fcrn 介導(dǎo)的再循環(huán)使分子容易出現(xiàn)較短的循環(huán)半衰期。

　　(2)同樣，生物制劑的微小尺寸促進(jìn)了聚集趨勢(shì)，從而產(chǎn)生具有增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的分子。從循環(huán)中被快速清除導(dǎo)致需要更高和重復(fù)的劑量。將 scFv 與牛血清白蛋白 (BSA) 或聚乙二醇 (PEG) 融合的方法可能提高其半衰期保留率，但由于分子大小的增加和實(shí)驗(yàn)成本的增加，它們的劣勢(shì)也可能蓋過(guò)scFv相較于mAb的優(yōu)點(diǎn)。

　　(3)linker肽的組成可以影響目標(biāo)生物制劑的理化性質(zhì)及其體內(nèi)活性。重復(fù)linker被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致與基于PCR的方法和免疫原性相關(guān)的問(wèn)題。替代的非重復(fù)linker已被用于改善其體內(nèi)活性，但與重復(fù)linker相比它們的靈活性較差。

　　4.2 scfv抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)存在的挑戰(zhàn)

　　與生成重組全長(zhǎng)抗體相關(guān)的挑戰(zhàn)同樣適用于小片段抗體分子，包括但不限于使用生物工程重組抗體、表達(dá)、純化、安全性和穩(wěn)定性控制平臺(tái)的技術(shù)。

　　(1)噬菌體展示技術(shù)用于產(chǎn)生全人源或人源化的scFv抗體分子，存在實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性、時(shí)間長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。

　　(2)使用整合了人類(lèi)免疫球蛋白位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，需要將重組基因整合到新產(chǎn)生的宿主動(dòng)物中，程序繁瑣。

　　(3)為產(chǎn)生具有VL和VH結(jié)構(gòu)域自然組合的天然人類(lèi)抗體而開(kāi)發(fā)的單B細(xì)胞技術(shù)涉及諸如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)和微孔板等篩選技術(shù)，以找出表達(dá)目標(biāo)抗體的單細(xì)胞，仍然是非常昂貴的過(guò)程。

　　4.3 scfv表達(dá)系統(tǒng)的局限性

　　(1)使用的表達(dá)系統(tǒng)限制了scFv 抗體的構(gòu)象折疊和產(chǎn)量。原核系統(tǒng)在表達(dá)過(guò)程中缺乏蛋白質(zhì)糖基化，還會(huì)形成內(nèi)毒素，難以從培養(yǎng)基中去除。

　　(2)真核生物單細(xì)胞表達(dá)則存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER 內(nèi)分子錯(cuò)誤折疊的問(wèn)題。盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可用于減輕蛋白質(zhì)折疊和糖基化模式的限制，但這些細(xì)胞系之間的遺傳變異性可能會(huì)將不同的末端聚糖表位添加到與人類(lèi)自然構(gòu)象不同的重組蛋白中，因此可能不是生產(chǎn)抗體片段的良好平臺(tái)。

　　(3)最近開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)也受到提取、純化程序和微生物表達(dá)系統(tǒng)等有限糖基化模式的影響。

　　(4)使用昆蟲(chóng)細(xì)胞的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)也受到N-連接糖基化的翻譯后修飾的限制，以及由于病毒以裂解方式感染昆蟲(chóng)細(xì)胞而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)染困難，妨礙了重組蛋白在批量培養(yǎng)中的持續(xù)生產(chǎn)。

　　(5)另一方面，scFv 抗體蛋白的純化更為復(fù)雜，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中沒(méi)有 Fc 結(jié)構(gòu)域。因此，無(wú)法通過(guò)蛋白A或蛋白G親和層析進(jìn)行純化，需要多模式操作，包括不同的色譜和非色譜相互作用。為了選擇性捕獲和高效純化，scFv抗體通常會(huì)融合親和標(biāo)簽，但在末端的蛋白酶切割可能無(wú)法完全去除標(biāo)簽，并留下部分殘余氨基酸，這可能導(dǎo)致scFv抗體的聚集和/或錯(cuò)誤折疊，甚至增加其免疫原性。

　　5. 未來(lái)展望

　　(1)將scFv抗體與其他免疫分子如細(xì)胞因子或趨化因子進(jìn)行基因融合，可以有效地將抗體分子定向到疾病區(qū)域或在病理?xiàng)l件下表達(dá)的特定分子上。減少了抗體片段對(duì)健康細(xì)胞的不利影響，從而通過(guò)靶向其生物活性來(lái)提高其治療指數(shù)。此外，scFv抗體具有更強(qiáng)的靈活性，由于其片段小，可以被修飾以解決全長(zhǎng)mAbs在實(shí)體瘤治療和診斷中相關(guān)的療效問(wèn)題。

　　(2)抗體分子通常局限于細(xì)胞外環(huán)境，因?yàn)樗鼈儫o(wú)法穿越脂質(zhì)雙層。但scFv抗體可以通過(guò)與納米載體、細(xì)胞穿透肽結(jié)合，或構(gòu)建具有識(shí)別細(xì)胞表面受體的序列結(jié)構(gòu)，從而通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞。因此，它將僅識(shí)別癌細(xì)胞的目標(biāo)分子，減輕化療和放療帶來(lái)的副作用。

　　(3)由于重組抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，scFv抗體的分子量、結(jié)合親和力、化合價(jià)等特性可以根據(jù)應(yīng)用目的進(jìn)行大幅度的修改和優(yōu)化。生產(chǎn)成本、與治療費(fèi)用相關(guān)的上市后問(wèn)題以及藥代動(dòng)力學(xué)特性都有望得到大幅改善，有望解決制藥公司和患者的巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

　　(4)除了用于親和力選擇的展示技術(shù)外，利用生物信息學(xué)能夠更容易地分析所研究的scFv抗體結(jié)構(gòu)中的誘導(dǎo)突變，特別是針對(duì)CDR，通過(guò)隨機(jī)或熱點(diǎn)誘變來(lái)預(yù)測(cè)其對(duì)天然抗體的高親和力特性。