緣由：
客戶咨詢購(gòu)買(mǎi)的三鷹抗體放-20℃，購(gòu)買(mǎi)的Santa抗體卻要放4℃？購(gòu)買(mǎi)的Biolegend重組蛋白（液體）如何保存，一次性用不完，是否需要分裝，如何分裝？
那抗體應(yīng)該儲(chǔ)存在什么溫度條件？不同廠家、不同種類的抗體由于性質(zhì)（固態(tài)、液態(tài)、標(biāo)記與否）、產(chǎn)品添加劑（甘油、疊氮鈉、牛血清蛋白、明膠）的不同，導(dǎo)致儲(chǔ)存條件也有所差異。具體以廠家說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
抗體的穩(wěn)定性：
抗體是免疫系統(tǒng)中最重要的分子之一，其穩(wěn)定性是自然進(jìn)化篩選的結(jié)果。在眾多物種中，抗體分子形成了保守而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，分子中70% 氨基酸殘基(免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)以beta片層(beta-sheet)形式堆疊，形成緊密并能耐受蛋白酶作用的“三明治"結(jié)構(gòu)，輕鏈和重鏈通過(guò)保守的二硫鍵形成具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白，大大提高了分子本身的穩(wěn)定性。
抗體主要涉及化學(xué)或物理不穩(wěn)定性?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性是指多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)共價(jià)鍵的形成或破壞。蛋白質(zhì)化學(xué)失活機(jī)制主要包括聚合作用、重要氨基酸的變化，如肽鍵在稀酸條件下被水解；半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸的氧化；二硫鍵的還原；用金屬離子修飾巰基形成硫醇鹽；天冬酰胺與谷氨酰胺的脫酰胺；氨基酸消旋，寡聚蛋白解聚成單體等。而抗體結(jié)構(gòu)的展開(kāi)、解離、變性、聚集和沉淀被稱為構(gòu)象或物理不穩(wěn)定性。
眾所周知，儲(chǔ)存條件（pH值、緩沖液類型、穩(wěn)定劑、防腐劑、蛋白酶抑制劑、溫度和反復(fù)解凍）在抗體穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用。
保存溫度：
每種樣品均有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高會(huì)引起許多物理和化學(xué)變化，如溫度升高10℃，氧化反應(yīng)約加快數(shù)倍，酶促反應(yīng)約增加1-3倍；又如多數(shù)蛋白在60℃以上開(kāi)始變性，熱變性通常是不可逆的，不利于物質(zhì)的穩(wěn)定存在。另外，適宜的溫度(如室溫)又是微生物污染的重要條件。而低溫卻可以抑制氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)及微生物生長(zhǎng)，使微生物處于生命遲緩和隱蔽狀態(tài)。故大多數(shù)生化樣品選擇低溫保存，其穩(wěn)定性可大大增加。
通常蛋白質(zhì)短期在4℃中儲(chǔ)存穩(wěn)定，不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)應(yīng)儲(chǔ)存在-20℃，而極不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)存儲(chǔ)在-70℃。然而在冷凍過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的小冰晶，形成更大的冰-水界面表面積，冰-水表面面積的增加與蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化和蛋白質(zhì)聚集的增加有關(guān)，因此需要避免反復(fù)凍融。
凍干粉抗體，穩(wěn)定性高，可在-20℃、-80℃條件中長(zhǎng)時(shí)間保存（長(zhǎng)達(dá)數(shù)年），4℃環(huán)境也較為穩(wěn)定。權(quán)衡各種因素，凍干粉抗體一般保存在-20℃，取用方便，保存時(shí)間長(zhǎng)。粉末狀抗體溶解后即變成液體狀態(tài)抗體，保存條件發(fā)生變化。需要按照說(shuō)明書(shū)或者液體抗體保存方法（最好分裝）。
為什么抗原抗體需要避免反復(fù)凍融？
抗原或抗體的保存條件非常重要，只要條件得當(dāng)，一般都可以保存幾個(gè)月到幾年。對(duì)于多數(shù)的抗原或者抗體而言，保存在-20℃或者-80℃是最佳的方法。
但是肯尼亞醫(yī)學(xué)研究所的Carolyne M. Kifude等在測(cè)試抗原rPfHRP2 的穩(wěn)定性中發(fā)現(xiàn)（Carolyne M. Kifude, etal. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Plasmodium falciparum Histidine-Rich Protein 2 in Blood, Plasma, and Serum，Clinical and Vaccine Immunology, 2008, 15(6): 1012–1018），反復(fù)凍融5次后，抗原的回收率開(kāi)始迅速下降。
原因是冷凍過(guò)程中，容器的內(nèi)壁產(chǎn)生的水冰晶體會(huì)產(chǎn)生“鹽析”效應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)和賦形劑越來(lái)越集中在容器的較慢冷凍中心。高鹽和/或高蛋白濃度可導(dǎo)致冷凍過(guò)程中沉淀和聚集，解凍時(shí)不能完全逆轉(zhuǎn)，從而使蛋白失效。
那么，如何避免反復(fù)凍融？
1、將抗體4℃保存，避免反復(fù)凍融。
Santa的抗體說(shuō)明書(shū)顯示4℃保存，請(qǐng)勿冷凍，抗體溶液含有0.1%的NaN3防腐。有實(shí)驗(yàn)顯示冷凍后抗體活性反而損失一半以上。
Jackson的抗體說(shuō)明書(shū)也顯示4℃保存，抗體溶液中居然還不含任何防腐劑。
2、將抗體分裝保存在-20℃或者-80℃，每次取一管解凍使用，避免反復(fù)凍融。
3、更多廠商的抗體需要保存在-20℃，如何避免反復(fù)凍融。
一些研究人員為了防止反復(fù)凍融造成的損失，會(huì)在抗體中添加冷凍保護(hù)劑。許多冷凍保護(hù)劑富含羥基，優(yōu)先吸附在蛋白質(zhì)分子附近，使蛋白質(zhì)優(yōu)先水合并因此穩(wěn)定。此外，冷凍保護(hù)劑可以通過(guò)延遲抗體溶液的冰結(jié)晶和共晶轉(zhuǎn)變來(lái)減少抗體聚集。因此，冷凍保護(hù)劑可用于抑制冷凍/解凍誘導(dǎo)的抗體聚集。
保護(hù)劑的實(shí)際冰點(diǎn)取決于保護(hù)劑的特性和濃度。當(dāng)儲(chǔ)存溫度低于冷凍保護(hù)劑抗體溶液的冰點(diǎn)時(shí)，溶液才會(huì)凝固。然而，通常會(huì)發(fā)生玻璃化（快速冷卻，低溫時(shí)形成的一種高黏度的介于液態(tài)和固態(tài)之間、非晶體、透明的玻璃態(tài)），而不是冰晶形成，在玻璃化過(guò)程中，溶液固化而不形成晶體，因此抗原或抗體的結(jié)構(gòu)完整性得以保持。
為提高穩(wěn)定性，通常添加甘油至終濃度為 50%，將冰點(diǎn)降低至 -22°C ，此時(shí)將抗體保存在-20°C冰箱，不會(huì)被冰凍起來(lái)，避免了反復(fù)凍融。
蛋白質(zhì)保存濃度：
通常蛋白質(zhì)的濃度也是影響穩(wěn)定性重要因素，一般蛋白質(zhì)在高濃度(1 mg/ml或者更高)溶液中比較穩(wěn)定，不容易降解，因?yàn)橐簯B(tài)蛋白質(zhì)容易受水化作用的影響，保存時(shí)濃度不能太低，否則可能引起亞基蛋白和輔助因子解離，會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)松散，穩(wěn)定性下降而易于失活。
因此部分抗體試劑中加入了牛血清白蛋白（BSA）作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑來(lái)防止降解。加入BSA能夠抑制冷凍引起的蛋白質(zhì)去折疊，通過(guò)增加蛋白質(zhì)的起始濃度，能夠增強(qiáng)在凍融過(guò)程中蛋白質(zhì)制備物對(duì)損傷的耐受性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的起始濃度增高時(shí)，抗體變性的百分比也會(huì)下降。另一方面，加入的蛋白還能盡可能減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。
當(dāng)抗體稀釋至工作濃度后，應(yīng)當(dāng)及時(shí)使用，在4℃盡量不要超過(guò)1天。
抗體的分裝：
分裝可以最大限度地減少因反復(fù)凍融導(dǎo)致的損失，因?yàn)榉磸?fù)凍融會(huì)使抗體變性，導(dǎo)致抗體形成聚合物，從而降低抗體的結(jié)合能力。分裝還可以最大限度地減少因多次移液引發(fā)的污染。
對(duì)于添加50%甘油的抗體，一般不需要分裝。原因是添加50%甘油，冰點(diǎn)降為-22°C，當(dāng)放在-20℃時(shí)保存不會(huì)結(jié)冰，不存在反復(fù)凍融風(fēng)險(xiǎn)；另外，抗體分裝可能會(huì)降低抗體效價(jià)。由于抗體溶液體積一般都比較小，管壁的吸附作用、水蒸氣的冷凝作用都不容忽視，兩種效應(yīng)會(huì)使得分裝后抗體的有效濃度降低，效價(jià)降低。并且，分裝體積越小，效價(jià)損失越大。
分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用完為好，但最少每份不能少于 10 µl ，分裝體積越小，儲(chǔ)備液濃度就越容易受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。復(fù)融后的分裝抗體一次用不完，需將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來(lái)，4℃可以短期保存（一到兩周）。
防止污染：
微生物污染也是造成蛋白質(zhì)降解的常見(jiàn)因素，為了防止微生物污染，首先要保證在無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行生產(chǎn)，并將疊氮鈉作為抗菌劑加入抗體溶液中，終濃度為 0.02% (w/v)。其本質(zhì)是呼吸鏈阻斷劑，和氰化物一樣可以阻斷生物氧化呼吸鏈的最后一步。起到保持抗體活性的同時(shí)，還能達(dá)到最佳的抑菌效果。
疊氮鈉對(duì)大部分生物體有劇毒，能夠阻斷細(xì)胞色素電子傳遞系統(tǒng)。故含疊氮鈉的抗體不適用于活細(xì)胞和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)疊氮鈉會(huì)抑制HRP活性，故也不能用于HRP-抗體的防腐。原因是疊氮鈉的（CN-）離子能夠與過(guò)氧化酶的鐵離子結(jié)合，從而抑制其活性。
疊氮鈉會(huì)干擾與氨基有關(guān)的結(jié)合，所以在抗體結(jié)合熒光素前應(yīng)該進(jìn)行去除疊氮鈉，或者選擇不含疊氮鈉不含甘油的抗體。
由于疊氮鈉劇毒，屬于管制化學(xué)品，因此國(guó)內(nèi)抗體廠家不少改成更安全的Proclin 300。
特殊抗體保存條件：
1、酶標(biāo)抗體，堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體對(duì)于冷凍特別敏感，一般在4℃短期存儲(chǔ)，長(zhǎng)期保存最好是在終濃度為50％的甘油中于-20℃保存。雖然某些酶可在無(wú)保護(hù)劑的情況下于-20℃儲(chǔ)存，但必須分裝，反復(fù)凍融會(huì)降低酶活力或促進(jìn)抗體聚集，影響抗體結(jié)合能力。
2、流式抗體（熒光素標(biāo)記抗體），流式抗體由于標(biāo)記物為熒光素（FITC、PE、APC等），對(duì)光十分敏感，需要避光保存。此外，熒光素特別是蛋白類熒光素，熒光基團(tuán)是嵌在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部，冷凍會(huì)破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，從而影響熒光效率；而化學(xué)熒光基團(tuán)在反復(fù)凍融之后也會(huì)淬滅，故一般采用不加甘油4℃避光保存。
抗體為什么要4℃運(yùn)輸？
一般抗體快遞運(yùn)輸需要2-3天左右，所以需要在低溫條件下來(lái)完成的。低溫運(yùn)輸一般分為冰袋和干冰兩種，由于大多數(shù)抗體都是4℃或-20℃保存，而干冰溫度能達(dá)到-78.5℃，如果使用干冰運(yùn)輸，那么抗體將被冰凍，收到抗體保存時(shí)，按照說(shuō)明書(shū)放4℃或者-20℃，抗體就多了一次凍融過(guò)程，所以運(yùn)輸過(guò)程中一般避免干冰運(yùn)輸，而選擇4℃運(yùn)輸，最主要的目的是為了避免反復(fù)凍融影響抗體的活性。
