外泌體樣本的ELISA實驗怎么做？
發(fā)布時間：2021-08-22 20:33:14來源：
外泌體（exosomes）是細胞分泌的微小囊泡，直徑約30-100nm，存在于大多數(shù)體液(如血液、尿液和脊髓液)和細胞培養(yǎng)液當中。近年來，科研工作者在闡明外泌體的生理、病理生理功能及針對這些功能的臨床應(yīng)用方面開展了大量研究，尤其是疾病的診斷、治療應(yīng)用（如生物標志物的開發(fā)）方面。研究表明，腫瘤細胞的外泌體會釋放與血管生成和免疫逃逸相關(guān)的分子標志物，說明外泌體可能與腫瘤細胞微環(huán)境的創(chuàng)建和促腫瘤生長有關(guān)1。此外，外泌體表面黏附分子的表達譜決定了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的終點2。可見外泌體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的研究價值。
在外泌體課題研究中，定量分析自然是必不可少的一步。ELISA是一種較為簡單的檢測樣本中特定蛋白或細胞因子含量的方法。常見的ELISA檢測樣本有血清、血漿、組織、細胞上清等，那么外泌體樣本的ELISA（以下均簡稱exo-ELISA）如何檢測？應(yīng)用場景是什么？其原理是什么？與普通ELISA技術(shù)相比，exo-ELISA檢測有哪些不同？讓我們一起來看看。
一、雙抗體夾心法
將已知的外泌體表面分子（如CD9、CD63、CD81）作為標志物，事先將特定外泌體分子標志物的一抗包被于板底。當加入一定濃度的含外泌體的樣本時，一抗就可以識別外泌體表面分子，實現(xiàn)捕獲外泌體的目的。e.g.常用的ExoELISA-ULTRA外泌體定量分析檢測試劑盒具有超高的靈敏度。
圖1. 雙抗體夾心法檢測exosomes原理示意圖
二、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）親和技術(shù)
已知Tim4（T細胞免疫球蛋白域和含粘蛋白域的蛋白4）可以通過位于細胞外區(qū)域的IgV結(jié)構(gòu)域與PS結(jié)合，并具有鈣離子依賴性3。而在螯合劑的作用之下，鈣離子與螯合劑的配位原子相結(jié)合，致使Tim4與PS分離開來。
與雙抗體夾心法不同的是，PS親和技術(shù)檢測exo-ELISA是使用磷脂酰絲氨酸事先包被的微孔板、生物素化的CD9、CD63、CD81一抗、親和素標記的辣根過氧化物酶，借助于抗原-抗體反應(yīng)、生物素-親和素的結(jié)合反應(yīng)來檢測待測樣本中外泌體含量的一種方法。與外泌體表面標記的特異性抗體相比，Tim4能夠高效地捕獲來自多種細胞類型的外泌體。這種方法也適用于外泌體的純化。
圖3. 不同種類包被蛋白的檢測靈敏度對比
三、磁珠法
磁珠法的基本原理是采用生物素標記的外泌體，親和素標記的磁珠，利用生物素-親和素的結(jié)合反應(yīng)來對低外泌體含量的樣本（如尿液、細胞上清）進行純化。
圖4. 磁珠法純化外泌體
四、基因工程的方法
DARPins是人工合成的由兩個α-螺旋和一個β-轉(zhuǎn)角的重復結(jié)構(gòu)組成的合成肽，被設(shè)計為受體蛋白等多種靶點（如：Her2）的結(jié)合域。DARPin -G3表達于慢病毒衣殼或細菌表面，被報道可用于腫瘤的靶向治療，是具有潛力的、可以克服單克隆抗體局限性的蛋白類治療因子。
Khodashenas等4用重組LAMP-DARPins包裝的慢病毒感染HEK293T細胞，使得外泌體表面表達重組嵌合蛋白。通過ELISA檢測外泌體表面重組抗原的表達，來表征外泌體的含量。DARPins-G3是專門針對表皮生長因子Her2設(shè)計而成的，因此可以用于檢測Her2+的SKBR3細胞外泌體的含量（圖5）。該方法用于外泌體的捕獲和純化過程。
圖5. 外泌體表達的DARPins與細胞表面Her2分子之間的反應(yīng)
注：用MDA231細胞作為Her2陰性對照細胞，SKBR3為Her2陽性細胞。
五、PD-L1液體活檢新方法的開發(fā)
研究表明，循環(huán)外泌體PD-L1水平可以區(qū)分腫瘤的存在，并與免疫治療的反應(yīng)有很好的相關(guān)性。2020年1月由楊朝勇教授4等開發(fā)的用于腫瘤液體活檢的外泌體PD-L1 ELISA檢測方法，通過篩選獲得的PD-L1核酸適配體，結(jié)合微量熱泳動效應(yīng)，在較少的樣本體積、均質(zhì)性差的體液條件下，能夠獲得均質(zhì)、高效、高靈敏度的檢測結(jié)果。
篩選過程中發(fā)現(xiàn)，MJ5對癌細胞表面PD-L1的結(jié)合效果最好，且對PD-L1陰性細胞無明顯的結(jié)合。MJ5適配體經(jīng)進一步優(yōu)化得到由33個核苷酸組成的、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的MJ5C。
流式細胞術(shù)分析顯示，PD-L1陽性細胞MJ5C核酸適配體的熒光強度高于對照序列，PD-L1陰性細胞未見明顯的熒光增強（圖7A-B）。
結(jié)合親和力是指單個生物分子（如蛋白質(zhì)或DNA）與其配體（如藥物）之間相互結(jié)合的強度，通常通過平衡解離常數(shù) (Kd) 來衡量。Kd值越小代表配體與蛋白質(zhì)的親和力越大。結(jié)合親和力分析顯示：PD-L1陽性細胞MJ5C核酸適配體與對照核酸適配體的熒光強度比不僅遠高于已報道的真核細胞選擇PD-L1蛋白的PD-L1適配體，而且比對照抗體的熒光強度比高約3倍（圖7C）。這些結(jié)果表明，MJ5C適配體不僅具有良好的選擇性，而且相比于PD-L1抗體組，它與PD-L1的結(jié)合效率更高。這種結(jié)合效率的提高可能是因為PD-L1的空間位阻效應(yīng)，而MJ5C核酸適配體比PD-L1抗體小，因此較容易地避免了糖基化所產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)。
為了證明這一假設(shè)，首先用肽-N-糖苷酶F (PNGase F）處理細胞，以在被適配體或PD-L1抗體染色前削減總N-連接糖基化水平。適配體染色的2組（糖基化/去糖基化組）之間熒光強度無明顯變化；而與未處理相比，PNGase F處理后PD-L1陽性（HCT116）細胞的抗體染色熒光強度增強（圖7D-E）。這些結(jié)果表明PD-L1的糖基化阻礙了PD-L1抗體對其的識別，而PD-L1適配體MJ5C受空間位阻的影響較小，很可能是由于其體積減小了10倍。因此，與PD-L1抗體相比，MJ5C適配體具有更高的分子識別能力，可以顯著提高外泌體PD-L1檢測的敏感性。
圖7. MJ5C適配體與PD-L1抗體的結(jié)合性能比較
以上方法多是基于外泌體表面蛋白的檢測，那么研究某個蛋白分子A在外泌體中表達的基本邏輯思路是怎樣的呢？
首先，確定目的蛋白是位于外泌體囊泡內(nèi)還是囊泡表面。
如果目的蛋白位于囊泡表面，通過流式細胞術(shù)檢測即可，不需要透膜劑處理。具體方法為通過磁珠包被的IgA或者IgG進行捕獲，采用CD81/CD63/CD9等作為一抗進行檢測。
如果目的蛋白位于囊泡內(nèi)部，則需要將分離得到的外泌體囊泡做破膜處理，類似于細胞破膜處理。即用含SDS的RIPA裂解液提取蛋白，然后進行ELISA檢測。
所謂“細節(jié)決定成敗”，希望大家在實驗過程中多思考，抓住細節(jié)，多發(fā)高分文章！
【參考文獻】
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3. Miyanishi, M., Tada, K., Koike, M., Uchiyama, Y., Kitamura, T., & Nagata, S. (2007). Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor. Nature, 450(7168), 435–439.
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