內容簡介：

　　受到大分子(例如蛋白質)組裝成新功能單元的能力以及工程調節(jié)的納米材料的卓越光學性能的啟發(fā)，羊抗鼠免疫球蛋白(GAMI)作為與金錳氧化物整合的“crosslinker”(Au-MnOx)組裝“signal tracers (STs)-crosslinker-antibody (mAb)”，以提高mAb利用效率。值得注意的是，“信號示蹤劑-交聯(lián)劑-抗體”提高了約13.33倍抗體利用效率，完美解決了競爭型側流免疫層析(LFIA)中有限靈敏度和強信號之間的矛盾。Au-MnOx的黑色和粗糙結構提供了更高的比色亮度(約為AuNPs的2倍)和更強的mAb偶聯(lián)效率(高達92.47%)，這在功能組裝的前提下進一步提高了靈敏度，以強化競爭性免疫反應。此外，金錳氧化物合成簡單方便(室溫下約13分鐘)甚至可以與直接購買的商業(yè)產品相媲美，這表明使用Au-MnOx無疑提高了成本效益。最后，基于Au-MnOx-GAMI-mAb的LFIA通過提高mAb利用效率，并以經濟高效的方式增強免疫競爭反應，表現(xiàn)出高靈敏度(LOD：0.063 ng mL−1，用于克侖特羅(CLE)監(jiān)測)，為POCT免疫測定提供了一條參考途徑。

　　主要內容

Au-MnOx的合成與表征

　　首先使用不同體積的MnCl2通過一步氧化還原反應制備不同的Au-MnOx。在相同條件下偶聯(lián)抗體，然后表征了不同體積MnCl2合成的Au-MnOx所對應的T線強度，結果顯示T線在100 μL MnCl2時達到最高強度。之后測試了不同體積MnCl2合成的Au-MnOx的Zeta電位，綜合考慮T線強度和Zeta電位，最終選擇100 μL MnCl2合成Au-MnOx。之后通過TEM拍攝，(能量色散X射線光譜學)EDS，XRD，XPS等表征手段證明了Au-MnOx材料的合成。

　　圖1：Au-MnOx的合成與表征

Au-MnOx作為LFIA的信號示蹤劑的優(yōu)越性

　　通過在NC膜上噴涂不同濃度的AuNPs和Au-MnOx來評估二者的比色光學性能。結果表明，Au-MnOx在每個濃度梯度下表現(xiàn)顯著的咖啡環(huán)效應，這可能是AuNPs和Au-MnOx的比色差異顯著的原因之一。綜合來講，所提出的Au-MnOx的平均比色信號亮度是AuNPs的2.00倍±0.12倍。考慮到在相同濃度下更高的比色亮度無疑會減少免疫探針的數(shù)量，并最終提高競爭型免疫分析的靈敏度，這表明Au-MnOx憑借優(yōu)越的光學性能擁有巨大的潛力。之后又評估了Au-MnOx和AuNPs與抗體的偶聯(lián)模式及偶聯(lián)效率。Au-MnOx和AuNPs都可以通過抗體簡單混合實現(xiàn)偶聯(lián)。另一方面，通過icELISA統(tǒng)計了Au-MnOx和AuNPs與抗體的偶聯(lián)效率，與AuNPs作為信號示蹤劑比較，所提出的Au-MnOx在最佳免疫探針制備條件下表現(xiàn)出更高的偶聯(lián)效率(77.09至85.11%)，這表明抗體的浪費更少，成本效益更高。且Au-MnOx不管在合成溫度和總合成時間上都表現(xiàn)了突出的優(yōu)越性。

　　圖2：Au-MnOx作為LFIA系統(tǒng)中信號示蹤劑的優(yōu)勢

條件優(yōu)化及靈敏度增強機理研究

　　對AuNPs-AbCLE, Au-MnOx-AbCLE, and Au-MnOx-GAMI-AbCLE的Au-MnOx的濃度，K2CO3的體積，GAMI的體積，免疫探針體積等進行了優(yōu)化。圖3c-d中的SEM圖像清楚地顯示了大量Au-MnOx的存在，由于AuNPs的粒徑較小(約20 nm)，圖3b中的SEM圖像與陽性結果幾乎一致。與小粒徑信號示蹤劑相比，大尺寸的信號示蹤劑通常需要更少的免疫探針來產生相同的信號值，這意味著需要更少的抗體，從而最終提高靈敏度。此外，單個mAb可以同時與多個GAMI結合，形成基于間接探針的免疫網絡(Au-MnOx-GAMI-AbCLE)，這意味著獲得相似信號強度所需的抗體更少(方案1)。從圖3c(基于Au-MnOx的LFIA)和圖3d(基于Au-MnOx-GAMI的LFIA)可以看出，基于Au-MnOx的免疫探針相對分散，而基于Au-MnOx-GAMI的免疫探針相對聚集?；贕AMI的Au-MnOx免疫探針相對聚集在T線區(qū)(用黃色圓圈標記)，這可能是因為在基于Au-MnOx-GAMI的免疫探針中，幾個GAMI functional Au-MnOx通過一個抗體結合在一起。

　　圖3：靈敏度增強機制

基于Au-MnOx-GAMI的LFIA分析性能

　　作為評價LFIA生物傳感器分析性能的首要評價指標，獲得了視覺檢測限(vLOD)、截止值(COV)和計算檢測限(cLOD)，證明了基于Au-MnOx-GAMI的LFIA分析性能有所提高。結果如下圖所示。

　　圖4：Au-MnOx-GAMI-LFIA的分析性能

基于LFIA的CLE分析技術的性能評估

　　通過比較不同批次的試紙條和免疫探針的T線強度來測試免疫測定方法的重現(xiàn)性。結果顯示，多個批次的T線信號強度大致相等，變異系數(shù)(CV)為10.32%。之后使用基于Au-MnOx-GAMI的LFIA檢測了豬肉和牛肉樣品，實際樣品5倍稀釋即可消除基質干擾。

　　圖5：基于Au-MnOx-GAMI的LFIA的性能

　　結論

　　作者描述了一種“交聯(lián)劑”輔助的“STs-GAMI-mAb”組裝策略，用于有效提高抗體利用效率并增強LFIA系統(tǒng)中的競爭性免疫反應?；贏u-MnOx-GAMI的LFIA在檢測克倫特羅時的cLOD為0.063 ng mL-1(與AuNPs-LFIA相比提高了約9.37倍)，之后又驗證了Au-MnOx-GAMI-LFIA在豬肉和牛肉樣品中的實用性，為分析化學支持的免疫測定領域提供了有力的參考。

　　原文出處

　　Liu, S.; Shu, R.; Zhang, M.; Zhao, C.; Wang, K.; Zhang, J.; Sun, J.; Dou, L.; Zhang, D.; Wang, J. Goat Anti-Mouse Immunoglobulin as “Crosslinker” Assisted Signal Tracer Assemble with Intensive Antibody Utilization Efficiency for Sensitive Paper-Based Strip Nanobiosensors.Int. J. Biol. Macromol.2023,258(Pt 2), 128923.

　　指導老師：王戰(zhàn)輝