【摘要】

大麻毒素的高靈敏檢測對于現(xiàn)場快速篩查非法藥物非常重要，大麻的主要成分為（-）Δ⁹ -四氫大麻酚（THC）。本研究制備了通過N-(3-二甲氨基丙基)-N ' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)捕獲抗體的硝酸纖維素膜（NC膜），以檢測抗體-THC免疫復合物。TEMPO氧化的納米纖維素（TOCNF）具備高體表面積比、OH基團豐富、高親水性等優(yōu)點。在表面等離子體共振（SPR）中觀察到抗體牢固結(jié)合在NC膜上且保持了生物活性，檢測范圍為1-10 μg/mL。使用HRP標記的檢測抗體作為檢測抗體，通過比色法在紙基上實現(xiàn)了THC的定量檢測，與依靠靜電作用的物理吸附連接的界面相比，共價作用連接的界面檢測效率更高。雖然抗體與未修飾的NC膜能夠有效結(jié)合，但超分子吸附導致的捕獲抗體與免疫復合物的結(jié)合率較低，因此，本研究開發(fā)的錨定捕獲抗體的NC膜具有重要意義。

1. 簡介

據(jù)聯(lián)合國《2021年世界毒品報告》稱，大麻是全球使用最多的非法藥物，約占全球毒品消費量的一半。大麻的主要精神活性成分是（-）Δ⁹ -四氫大麻酚(THC)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的受體結(jié)合可以引起欣快感，四氫大麻酚的代謝物11-甲基-9-羧基-9-四氫大麻酚(THC- COOH)，也是常見的檢測靶分子。隨著即時檢測需求的增加，唾液中靶標的檢測也是十分必要的。為了開發(fā)高度準確、靈敏的檢測方法，抗體或其他識別元件需要有效結(jié)合在檢測界面上，而吸附的不良可能導致抗體喪失生物活性或與流動相中的樣品分離。

NC膜通常被用作LFAs的反應膜，它能夠不可逆地結(jié)合蛋白質(zhì)，具有良好的信噪比。商業(yè)NC膜通常是疏水的，需要表面活性劑提供流動性，但表面活性劑的存在限制了捕獲抗體的結(jié)合。碳二酰亞胺交聯(lián)是使用最廣泛的偶聯(lián)帶有羧基或胺基化合物的方法，已有報道成功通過EDC/ NHS法將人抗免疫球蛋白抗體偶聯(lián)在TOCNF膜上，此外還有羧甲基纖維素(CMC)膜等。纖維素具有高生物相容性、低成本、低毒性等優(yōu)點，其吸水性和親水性促進了免疫復合物在水相中的相互作用。然而，在藥物快速檢測領(lǐng)域，基于TOCNF作為識別元件的錨定界面仍未經(jīng)探索。

方案1. 基于傳感元件固定在纖維素上的THC檢測系統(tǒng)示意圖。特異性抗THC的捕獲抗體(anti-IC)的伯胺基通過 EDC/NHS與 TOCNF 的羧基之間形成酰胺鍵，形成能夠結(jié)合抗 THC + THC 免疫復合物的生物界面。

方案1展示了TOCNF上的抗體通過EDC/NHS化學結(jié)合及目標免疫復合物與捕獲抗體結(jié)合的示意圖。SPR的核心部件包括光學系統(tǒng)、傳感器芯片、液體處理系統(tǒng)三個主要部分，基于SRP比較了生物界面偶聯(lián)抗體與物理界面吸附抗體的檢測性能。通過比較具有高電負性TOCNF和電中性纖維素的吸附能力，考察了表面電荷對分子相互作用的影響。此外，還建立了紙基比色法LFAs，納米纖維素吸水后的膨脹提供了親水間隔環(huán)境，有利于保持固定的捕獲抗體的功能活性，有利于結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)標記的捕獲抗體+THC復合體，減少了樣本液體流動時檢測抗體被消耗的風險。

2. 結(jié)果與討論

2.1. 捕獲抗體生物界面的制備及SPR中THC的檢測

首先驗證了捕獲抗體在TOCNF上的非特異性吸附。圖1a顯示了抗體吸附到TOCNF表面的SPR示意圖，帶負電的納米纖維素表面對帶正電的捕獲抗體(等電點6.5-9.5)有顯著的吸附作用，吸附質(zhì)量達1370 ng/cm²。并對照捕獲抗體在不帶電荷的纖維素表面上的吸附，在pH值為5時，捕獲抗體與TOCNF表面的主要依靠靜電作用吸附，顯示其吸附量高于EDC/NHS修飾的TOCNF(圖1A和表1)。此外，研究了表面、THC、捕獲抗體之間的非特異性相互作用，圖1B顯示無封閉試劑時，檢測抗體在TOCNF上有較高非特異性吸附，圖1C顯示僅有THC存在時，與TOCNF表面沒有表現(xiàn)出強相互作用，表1展示了非特定相互作用的吸附質(zhì)量。

表 1 SPR中的捕獲抗體固定和非特異性結(jié)合。

圖 1. SPR 傳感圖：a) 在 pH 5 下，15 μg/mL 捕獲抗體吸附到 TOCNF 和纖維素上，b) 15 μg/mL 捕獲抗體吸附在 TOCNF 上，有（藍色）和沒有（紅色）BSA 封閉， c) TOCNF 吸附 1 μg/mL THC（無封閉）。

此外，對于TOCNF表面物理吸附的抗體檢測免疫復合物靈敏度的研究也十分重要。盡管TOCNF上吸附了大量的抗體(圖2a和表1)，但經(jīng)過BSA封閉后不能有效結(jié)合免疫復合物(表2)，并且免疫復合物在洗滌后很容易從物理吸附的表面去除，表明物理吸附的抗體以非活性構(gòu)象附著，阻止了免疫復合物的正確結(jié)合。此外，與免疫復合物與TOCNF表面的相互作用比較，BSA封閉后TOCNF表面的相互作用具有相似的趨勢(圖2b)。

圖 2. SPR 傳感圖：a)捕獲抗體吸附到 TOCNF 上。b) 抗 THC + THC 免疫復合物與 15 μg/mL 抗 THC 和 1 μg/mL THC 吸附在 BSA 處理后的 TOCNF（紅色）和 BSA 阻斷的 TOCNF（藍色）上物理吸附的捕獲抗體表面上。c)將捕獲抗體偶聯(lián)到TOCNF上，經(jīng)EDC/NHS活化，隨后捕獲抗體和乙醇胺處理。d) BSA 處理后，TOCNF 上偶聯(lián)的捕獲抗體表面上吸附有 15 μg/mL antiTHC 和 2 或 10 μg/mL THC 的抗 THC + THC 免疫復合物，抗 THC (15 μg/mL) 結(jié)合到不含 THC (0 μg/mL) 的偶聯(lián)捕獲抗體 生物界面作為參考。

此后，比較化學偶聯(lián)抗體的結(jié)合效率發(fā)現(xiàn)，圖2C顯示出抗體在EDC/NHS激活后的TOCNF表面有較顯著吸附。乙醇胺(pH 8.5)處理后SPR角減小，推測pH的變化影響了蛋白質(zhì)的凈電荷，靜電相互作用的變化使抗體與界面結(jié)合松散。圖2D顯示了兩種濃度的免疫復合物以及僅有捕獲抗體存在時與生物界面的結(jié)合情況，與預期相同，在僅有檢測抗體存在時固定捕獲抗體的TOCNF表面上的結(jié)合率很低(表2)，而THC存在時能夠檢測到免疫復合體的結(jié)合。值得注意的是，盡管THC疏水性較強，但在高度親水的NC膜錨定表面與捕獲抗體發(fā)生了相互作用，可能由于水分子的排出導致化學反應的熵增加，宏觀上增加了捕獲抗體-THC的結(jié)合親和力。捕獲抗體+THC免疫復合體結(jié)合不能隨的捕獲抗體量的增加而增加(圖2和表2)，高濃度(10μg/mLTHc)使捕獲抗體+THc免疫復合物結(jié)合率增加約11%，低濃度(2μg/mLTHc)使結(jié)合率降低約25%。

表 2 捕獲抗體固定方法對 TOCNF 表面免疫復合物結(jié)合的影響。

2.2. 形貌變化

利用AFM成像技術(shù)展示了固載抗體、吸附牛血清白蛋白和免疫復合物對表面修飾碳納米薄膜形貌的影響（圖3）。

圖 3. SPR 傳感器上樣品的 AFM 圖像和分布：a) 原始 TOCNF，b) TOCNF 吸附的捕獲抗體生物界面，c) 暴露于 BSA 和 THC + 抗 THC的TOCNF 生物界面，d) TOCNF 偶聯(lián)捕獲抗體生物界面，以及 e) 暴露于 BSA 和免疫復合物后 TOCNF 上的偶聯(lián)捕獲抗體生物界面。、

2.3. THC在紙基的比色檢測

同樣以TOCNF為錨定層，采用EDC/NHS法將捕獲抗體固定在測試區(qū)(T)上，二抗(抗小鼠免疫球蛋白)附著在對照區(qū)域(C)上。用HRP標記捕獲抗體，在過氧化氫存在下與ABTS反應生成藍綠色產(chǎn)物(圖2),此外，3wt%的牛血清白蛋白和5wt%的酪蛋白水解物溶液作為封閉劑應用于底物上，采用THC陽性樣和THC陰性樣進行檢測。圖4顯示了不同樣品在測試區(qū)和控制區(qū)的示意圖及相應的顏色，四氫大麻酚陰性樣品檢測后，僅在控制區(qū)出現(xiàn)綠色圓點(圖4b)，在對THC陽性樣品進行測試后，在測試區(qū)和控制區(qū)都有著色，10-15 min得到比色結(jié)果（圖4c）。為了突出錨定層和有效固定抗體的重要性，我們在物理吸附抗體的TOCNF上進行了類似的測試，其他系統(tǒng)底物沒有著色。

圖4.試紙上的THC檢測：a)在試紙和對照區(qū)域上顯示固定的傳感元件的示意圖，b)在沒有THC(陰性樣本)存在的試紙上的對照區(qū)域上的抗THC-HRP結(jié)合示意圖和Abts的比色圖像，c)在試紙上與THC陽性樣本進行檢測時免疫復合物結(jié)合和對照區(qū)域上的抗THC-HRP結(jié)合的示意圖，以及在試紙上用THC陽性樣本進行檢測時在對照區(qū)域上的抗THC-HRP結(jié)合的示意圖。

3. 結(jié)論