本文綜述了四種代表性檢測小分子化合物的非競爭免疫分析方法：和;概述了小分子化合物非競爭性免疫分析的發(fā)展情況;討論了面臨的技術挑戰(zhàn)和可能的解決方案;旨在啟發(fā)小分子化合物免疫分析新方法的開發(fā)。

【正文】

開發(fā)非競爭性免疫分析

　　免疫分析由于其靈敏、易用和低成本等特點，被廣泛應用于診斷、環(huán)境與食品檢測。然而小分子化合物無免疫原性且僅有一個表位，其免疫分析常采用靈敏性低、工作范圍窄(相對夾心法免疫分析法)的競爭法。改進小分子化合物免疫分析的策略包括：設計半抗原改善免疫原性以制備高親和力抗體;開發(fā)新的信號放大材料或檢測模式如：量子點(QDs)、上轉換納米顆粒(UCNPs)、金屬有機框架(MOFs)、聚集誘導發(fā)光熒光微球(AIEgens)以提高靈敏度;以及以彌補競爭法的不足等。

基于抗獨特型抗體的免疫分析、基于抗異型抗體的免疫分析、開放夾心免疫分析

　　本文聚焦于非競爭性免疫分析的研究進展，介紹了四種具有代表性的非競爭性免疫分析：以及(圖1)，概述了這些方法在小分子化合物檢測領域的前景和挑戰(zhàn)。

　　圖1：小分子化合物非競爭性免疫分析發(fā)展的時間線。

一、基于抗獨特型抗體的免疫分析

　　根據(jù)Jerne的免疫網(wǎng)絡理論，抗獨特型(anti-idiotype)抗體(Ab2)是識別靶標特異性抗體(Ab1)可變區(qū)獨特位的抗體，具有免疫調節(jié)作用。Ab2包括Ab2α和Ab2β，Ab2β作為抗原內影像，靶向Ab1的抗原識別位點，可以完全阻斷抗原與Ab1結合，而Ab2α識別Ab1可變區(qū)域的其他表位。由于空間位阻，Ab2α和Ab2β不能同時結合Ab1。

　　1990年，Barnard和Kohen首次開發(fā)出雌二醇的抗獨特型免疫分析：當靶標存在時Ab1與銪標Ab2α結合，有信號;靶標不存在時Ab1與Ab2β結合，無信號，該方法LOD低至2 fmol(圖2A)。此后，檢測黃體酮，去氧膽酸7-N-乙酰氨基葡萄糖苷、11-脫氧皮質醇的抗獨特型免疫分析也被陸續(xù)報道(圖2B)。然而，產(chǎn)生Ab2的雜交瘤很難篩選，陽性克隆率通常低于1%(圖2C)。為提高篩選效率，可從噬菌體展示抗體庫中篩選重組抗獨特型抗體(rAb2)，如：單鏈抗體、納米抗體(圖2D)。

　　rAb2和Ab1之間的結合價也會影響分析靈敏度。當單價rAb2以兩倍于傳統(tǒng)mAb2的摩爾速率與mAb1結合時，可能會增強信號強度、提升靈敏度。然而當rAb2體積較小時，空間位阻不足，Ab1可能同時結合rAb2α和rAb2β從而產(chǎn)生錯誤結果。未來的研究應關注平衡Ab2的大小及其空間位阻的關系，制備相匹配的Ab2和Ab1。

　　圖2:抗獨特型免疫分析原理與示例

二、

　　相比于涉及三種抗體的抗獨特型分析，基于抗異型(metatype)抗體的非競爭性免疫分析更簡單。靶標和抗體結合形成免疫復合物(IC)后形成的新表位稱為異型位點。用免疫復合物作為抗原時，可能會產(chǎn)生僅識別異型位點的抗異型(抗IC)抗體(圖3A)，進而形成抗體-小分子化合物-抗異型抗體的偽夾心?；谠摬呗裕晒χ苽淞税邢?delta;9-四氫大麻酚、血管緊張素II和微囊藻毒素的抗IC mAb(圖3B)?？梢允褂酶鞣N展示技術更高效地篩選抗IC重組抗體(rAbs)(圖3C)。

　　制備抗IC抗體的關鍵問題在于抗體(Ab1)與靶標結合后引起構象變化形成新表位，而小分子化合物可能會被埋進mAb1或rAb1的結合口袋，產(chǎn)生非常隱蔽的構象變化。對此，可以用噬菌體展示的7–11隨機肽庫篩選抗IC肽，較小的體積使其能進入IC的腔或間隙與IC深處的異型位點相互作用從而建立抗IC免疫分析;該方法已被用于檢測莠去津、禾草敵。人工合成的抗IC肽有時會喪失親和力，或者單價合成肽結合相比噬菌體攜帶的肽親和力更差，原因可能是噬菌體維持了肽的構象。為解決這一問題，可以將合成肽與一些生物或有機大分子如：鏈霉親和素、志賀毒素以及十聚水溶性碳水化合物配體聚合物等進行偶聯(lián)以產(chǎn)生多價肽，增強親和力。

　　圖3:抗異型免疫分析原理與示例。

三、開放夾心免疫分析

　　1996年Ueda發(fā)現(xiàn)抗卵溶菌酶抗體的VH和VL之間的相互作用可以被抗原增強導致抗體可變區(qū)穩(wěn)定化，并基于這一現(xiàn)象開發(fā)了開放夾心免疫分析(OS-IA)。OS-IA僅使用一種抗體，避免了篩選多種抗體帶來的麻煩，已被成功用于玉米赤霉烯酮、苯甲醛、甲狀腺激素等小分子化合物的檢測。

　　顯然，建立OS-IA的關鍵在于如何篩選能被待檢靶標增強VH和VL互作的抗體。報道的篩選方法包括：基于分裂FV(spFv)的噬菌體篩選系統(tǒng)(圖4A)、基于Fab的噬菌體篩選系統(tǒng)(pDong1)(圖4B)以及從現(xiàn)有的雜交瘤產(chǎn)生的mAb中進行篩選?？梢栽诳蚣軈^(qū)引入點突變弱化VH-VL的初始相互作用提高OS-IA的信噪比。

　　根據(jù)是否需要洗滌分離，OS-IA被分為異相檢測、均相檢測。異相檢測常固定VL，再加入靶標和VH形成夾心復合物后檢測信號強度(圖4C)。報道的異相OS-IA包括：基于噬菌體的OS-ELISA、基于免疫場效應晶體管的OS-FET以及基于反向PCR的OS-IA。

　　均相檢測也被稱為開放夾心熒光免疫分析(OS-FIA)：將熒光分子分別偶聯(lián)至VH和VL，靶標驅動VH- VL互作后兩個熒光分子彼此接近，導致供體能量降低和受體能量增加并產(chǎn)生信號。被報道的OS-FIA包括：基于熒光素和羅丹明X的OS-FIA、基于突變GFP融合蛋白的OS-FIA以及基于海腎熒光素酶(RLuc)的OS-FIA。酶的寡聚化和蛋白片段互補分析(PCA)也可用于建立OS-IA。如：將β-半乳糖苷酶(β-gal)的兩種無活性的突變體δα和δω分別偶聯(lián)VH、VL，二者接近后形成活性酶(圖4D);以及基于納米熒光酶(NLuc)兩個片段的PCA建立OS-IA(圖4E)。

　　圖4: OS-IA抗體篩選方法與檢測示例。

四、基于淬滅體的免疫分析

　　將抗體與熒光染料(如TAMRA、R6G和ATTO等)偶聯(lián)制備的淬滅體(Q-body)也可用于建立均相非競爭性免疫分析。抗原不存在時，染料由于其疏水性靠近抗原結合區(qū)的色氨酸(Trp)殘基，發(fā)生光誘導電子轉移(PET)，關閉熒光;反之，抗原結合抗體后染料向外移動，阻止PET，打開熒光(圖5A)。

　　不難發(fā)現(xiàn)Q-body的作用依賴于抗原與染料的競爭，而抗體的抗原結合區(qū)往往位于N端，所以一般將染料標記在抗體N端。報道的標記策略包括：使用無細胞翻譯介導的位置特異性標記(圖5B)、在輕重鏈的兩個N端都引入染料構建Fab型Q-body、使用琥珀酸(UAG)密碼子或四堿基密碼子(CGGG)在同一Fab引入兩個不同的熒光染料、結合重組抗體的原核表達和巰基馬來酰亞胺標記大量制備Q-body(圖5C)、基于納米抗體制備Q-body等。

　　也可用直接偶聯(lián)法制備Q-body：如利用Rapoport’s salt在Fab N端特異性引入酮羰基偶聯(lián)具有氨基或酰肼基的熒光染料、用吲哚-3-丁酸偶聯(lián)的熒光素與抗體核苷酸結合位點(NBS)進行紫外光化學交聯(lián)構建scFv型Q-body、使用還原性烷基化反應選擇性標記抗體的N端α-氨基制備基于單抗或多抗的Q-body、基于卷曲螺旋寡聚化結構域快速制備卷曲Q-body、用金黃色葡萄球菌分選酶A(SrtA 7+)的突變體實現(xiàn)Q-body的多種熒光偶聯(lián)策略等。

　　由于結構、Trp殘基分布各異，不是所有抗體都能制備Q-body，所以Q-body的開發(fā)要進行大量篩選實驗，因此提高抗體篩選效率對Q- body的開發(fā)至關重要。提高篩選效率的嘗試包括：用蛋白M(PM)制成的抗體結合淬滅探針將Fab或IgG抗體轉化為Q-body(圖5D)、用來自人支原體的PM Q探針篩選Q-body的原型抗體、基于酵母展示和E4/K4-標簽相互作用篩選Q-body的原型抗體、基于結構分析設計和靶向修飾現(xiàn)有抗體設計Q-body繞過復雜的篩選程序。

　　圖5: Q-body免疫分析的原理、熒光染料標記方法與抗體篩選策略。

結論與展望

　　本文綜述了四種用于小分子快速檢測的非競爭性免疫分析方法。上述研究表明非競爭性免疫分析在小分子檢測方面既具有巨大的潛力也面臨著諸多挑戰(zhàn)。非競爭法所用的抗體可以通過動物免疫或展示技術制備，然而展示技術的局限性在于成本較高、庫容有限、譜系信息與親和力提升的可能性受損(與動物免疫相比)，因此未來的研究方向可能是結合動物免疫和體外展示技術的優(yōu)勢來改善抗體發(fā)現(xiàn)過程，同時為機器學習提供數(shù)據(jù)集。將新型材料如：MOF、分子印跡復合物、共價-有機框架、碳基材料、硅基材料、聚多巴胺衍生材料，用于前處理可以提高檢測的靈敏度和準確性;將其與非競爭性免疫分析結合是小分子快速檢測的一個重要發(fā)展方向。將所有反應步驟集成到微流控芯片的芯片實驗室(LOC)，有試劑消耗少、檢測速度快、便攜和能檢測護理點等優(yōu)點，也為非競爭性免疫分析開辟了新的可能性。

【原文出處】

Liang, Y.-F.; Yang, J.-Y.; Shen, Y.-D.; Xu, Z.-L.; Wang, H. A Breakthrough of Immunoassay Format for Hapten: Recent Insights into Noncompetitive Immunoassays to Detect Small Molecules.Crit. Rev. Food Sci. Nutr.2024, 1–11.

　　指導教師：王戰(zhàn)輝