緣起：

　　客戶咨詢ELISA試劑盒，其中有一個指標(biāo)是小分子化合物，經(jīng)過查詢居然有夾心法。常識中，免疫分析測小分子都采用競爭法，原因是小分子化合物與對應(yīng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)多為穴狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小分子的大部分結(jié)構(gòu)被包埋，難以被另外一個抗體結(jié)合導(dǎo)致無法使用夾心免疫分析法進(jìn)行檢測，那為什么ELISA試劑盒中又出現(xiàn)夾心法測小分子呢?要弄明白這個問題，首先要從免疫分析中的競爭法和非競爭法說起。

免疫分析法

　　1960年，美國科學(xué)家Rosalyn Yalow(1921～2011)和 Solomon A. Berson(1918～1972)在研究糖尿病時，第一次使用I-125 標(biāo)記胰島素測量糖尿病患者尿液中的胰島素水平，解決了之前難以測定的微量生物活性物質(zhì)的臨床檢測問題(Yalow R S, Berson S A. Immunoassay of endogenous plasmainsulin in man[J]. Clin Invest, 1960, 39(1): 1157-1175)。從此，開起了免疫分析的序幕。

　　免疫檢測原理：利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測，采用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等作為標(biāo)記檢測信號，從而實(shí)現(xiàn)對抗原或抗體的定量或定性分析。常被用于檢測蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。免疫診斷在臨床診斷中占據(jù)著非常重要的地位，常見的免疫技術(shù)有放射性免疫、酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光。

　　‌免疫分析一般分為競爭性方法和非競爭性方法，主要區(qū)別在于它們與抗原和抗體的結(jié)合方式不同。‌

　　‌競爭性方法‌主要利用標(biāo)記待測物和待測物，與特異性抗體之間的競爭性結(jié)合原理。在這種方法中，標(biāo)記抗原與未知抗原(待測樣品中的抗原)同時存在時，會與固定量的抗體進(jìn)行競爭結(jié)合。當(dāng)未知抗原的量增加時，標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的量就會減少，這種減少的量與未知抗原的量之間存在一定的函數(shù)關(guān)系。通過測量這種減少的量，可以計(jì)算出未知樣品中抗原的濃度。這種方法要求有高純度的標(biāo)記抗原，并且需要尋找合適的標(biāo)準(zhǔn)品來繪制劑量反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測樣品的濃度‌。

　　小分子化合物的單克隆抗體的親和常數(shù)在一般情況下很難超過10∧12 mol/L,這就決定了競爭性分析模式難以達(dá)到亞飛摩爾濃度的測量水平。另外,在低濃度的反應(yīng)信號很難與背景信號區(qū)別開來，存在待測物低濃度的相對誤差較大，分析過程的重現(xiàn)性差,反應(yīng)孵育時間過長,所有上述因素致使競爭性免疫分析在靈敏度、精密度、動力學(xué)及工作曲線范圍方面都不及非競爭免疫分析。

　　‌非競爭性方法‌(如夾心免疫法)則涉及使用一個捕捉抗體和一個檢測抗原的抗體。這種方法要求抗原分子足夠大，以包含兩個抗原表位，每個抗體都能充分無阻地結(jié)合抗原，從而實(shí)現(xiàn)對樣品分析物進(jìn)行檢測和定量。非競爭性方法通常用于測量大分子抗原或抗體，它們需要一個捕捉抗體將抗原固定在載體表面，然后加入一個酶標(biāo)記的特異性檢測抗體進(jìn)行檢測，產(chǎn)生可測量的信號‌。這種檢測模式不適用于小分子化合物，血管緊張素Ⅱ是迄今為止采用雙位點(diǎn)夾心法能夠測量到的最小分子(相對分子質(zhì)量1048)。

　　這兩種方法各有特點(diǎn)，競爭性方法適用于小分子物質(zhì)的測量，因?yàn)榘肟乖目臻g結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了它不能同時與兩株抗體結(jié)合，如藥物、激素和毒素等，其中需要使用一個標(biāo)記的抗原進(jìn)行競爭;而非競爭性方法則更適合于大分子物質(zhì)的測量，如蛋白質(zhì)和病毒等，它通過夾心式的方式檢測和分析物。這兩種方法在免疫分析中都有廣泛的應(yīng)用，選擇哪種方法取決于待測物質(zhì)的性質(zhì)和分析的具體需求‌

小分子化合物簡介

　　小分子化合物(相對分子質(zhì)量通常小于1000)，如抗生素，化學(xué)藥物、小分子腺激素、小分子肽、維生素和多糖等，這類化合物在免疫反應(yīng)中只具有反應(yīng)原性，而沒有免疫原性，通常在免疫化學(xué)上被定義為半抗原。很難產(chǎn)生免疫應(yīng)答，只有通過與大分子蛋白或者載體蛋白結(jié)合，形成“完全抗原”，才能具有免疫原性，產(chǎn)生特異性識別小分子抗原的抗體。由于分子體積和空間位阻的原因，小分子化合物通常只有一個抗原表位，免疫測定一般采用競爭性分析模式。

　　臨床應(yīng)用方面常見的小分子有很多，如T3、T4、雌二醇、孕酮、醛固酮、25羥基維生素D、他克莫司、環(huán)孢霉素等。

基于生物素-親和素體系的非競爭性免疫分析方法

　　1990年Ishikawa等(E Ishikawa, K Tanaka, S Hashida. Novel and sensitive noncompetitive (two-site) immunoassay for haptens with emphasis on peptides[J]. Clinical Biochemistry, 1990, 23(5): 445-453.)提出了基于生物素親和素體系檢測小分子肽的雙位點(diǎn)夾心免疫分析模式。

　　由于小分子肽只有單一抗原表位，傳統(tǒng)的夾心法無法檢測。研究者設(shè)計(jì)依賴于使用強(qiáng)親和系統(tǒng)，即生物素-親和素復(fù)合物。生物素與分析物共價偶聯(lián)獲得兩個抗原位點(diǎn)進(jìn)而可以采用夾心免疫檢測。

　　檢測原理是生物素化后的待測物可同時結(jié)合半抗原抗體和固相的親和素，從而可建立針對半抗原的雙位點(diǎn)夾心式的非競爭性分析方法。反應(yīng)過程大致如下：

　　1、在待測物分子上標(biāo)記上生物素，從而生成一個體積更大的生物素化待檢物的復(fù)合物，該復(fù)合物產(chǎn)生第二個表位(生物素抗原表位);

　　2、生物素化的待測物經(jīng)固相抗體純化后，再與標(biāo)記抗體混合;

　　3、轉(zhuǎn)移到預(yù)包被有親和素的固相載體上，進(jìn)行夾心非競爭性反應(yīng);

　　4、最后，記錄信號強(qiáng)度，信號強(qiáng)度與樣品中待測抗原的含量成正相關(guān)。

　　這種分析方法已經(jīng)成功應(yīng)用到具有伯氨基的血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素等小肽以及甲狀腺素的測定。然而，生物素化反應(yīng)和親和純化過程復(fù)雜且耗時，限制了這種方法的應(yīng)用。

　　此外，‌確保檢測的準(zhǔn)確性需要對樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理(全血，血清或血漿)，并盡量減少對樣本的過多干擾，才能確保對樣本的溯源。這種方法對樣本進(jìn)行生物化標(biāo)記處理，還需要經(jīng)過親和純化過程，對樣本產(chǎn)生諸多干擾，作為一種探索方法算是創(chuàng)新了，但是無法適應(yīng)現(xiàn)代檢測高效，快速，準(zhǔn)確的理念，導(dǎo)致無法在臨床檢驗(yàn)中有效推廣和應(yīng)用‌。

基于抗獨(dú)特型抗體的非競爭性免疫分析方法

　　抗獨(dú)特型抗體(Anti-idiotype Antibody，Ab2)是針對抗體( Ab1)可變區(qū)的抗原決定簇，即抗體的獨(dú)特位所產(chǎn)生的特異性抗體。獨(dú)特型的差異由抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)內(nèi)氨基酸序列不同造成。

　　抗獨(dú)特型抗體有Ab2α和Ab2β兩種。Ab2α識別抗體可變區(qū)骨架區(qū)內(nèi)的獨(dú)特型決定簇，是抗體中遠(yuǎn)離抗原結(jié)合部位的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體，不影響Ab1與抗原的結(jié)合，屬半抗原非抑制性Ab2。Ab2β由抗體的抗原結(jié)合部位處的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體,可完全抑制抗原與Ab1的結(jié)合，有效阻斷Ab1對抗原的識別，被認(rèn)為是抗原的“內(nèi)影像”。

　　1990年Bamard 等( Barnard G， Kohen F. Idiometric assay : noncompetitive immunoassay for small molecules typified by the measurement of estradiol in serum. Clinical Chemistry, 1990, 36(11): 1945-1950)報(bào)道建立了一種基于抗獨(dú)特型抗體檢測小分子化合物的非競爭性免疫分析方法，并用于血清中雌二醇的測定。反應(yīng)過程大致如下：

　　1、加入分析物或標(biāo)準(zhǔn)品與固定抗體(Ab1)反應(yīng);

　　2、加入Ab2β，封閉Ab1中未被待測物占用的結(jié)合位點(diǎn);

　　3、加入標(biāo)記的Ab2α，由于空間位阻，Ab2α不能和Ab2B/Ab1復(fù)合物結(jié)合，而是識別捕獲有待測物的那部分抗體的骨架區(qū)位點(diǎn);

　　4、最終讀出的信號強(qiáng)度與抗體結(jié)合的待測物分子數(shù)量，也就是樣品中待測物的含量成正相關(guān)。

　　這種方法先后成功應(yīng)用于雌二醇、皮質(zhì)醇、甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的測定。但是抗獨(dú)特型抗體的制備有一定難度，陽性克隆率低，抗體分型篩選復(fù)雜，獲得配對效果較好的Ab2α和Ab2β困難，限制了此方法的開發(fā)和應(yīng)用。

基于固相固定化表位體系的非競爭性免疫分析方法

　　1994年P(guān)radelles等(Pradelles P, Grassi J, Creminon C, et al. Immunometric assay of low molecular weight haptens containing primary amino groups. Analytical Chemistry, 1994, 66(1):16-22)報(bào)道了基于固相固定化表位體系的非競爭性免疫分析方法(Solid -phaseImmobilized Epitope Immunoassay , SPIE-IA)用于檢測小分子半抗原。

　　這種方法基于捕獲抗體和檢測抗體相繼識別的單個表位，涉及分析物與固相的共價交聯(lián)。反應(yīng)過程大致如下：

　　1、用固定化抗體捕獲半抗原分析物(標(biāo)準(zhǔn)物或樣品);

　　2、半抗原分子的氨基基團(tuán)通過雙功能試劑(戊二醛、雙琥珀酰亞胺辛二酸酯等)與固相抗體發(fā)生化學(xué)共價偶聯(lián);

　　3、生物偶聯(lián)后，在酸、堿或有機(jī)溶劑的變性作用處理下，半抗原表位由抗體結(jié)合位點(diǎn)處釋放;

　　4、借助共價健偶聯(lián)在固相載體上的半抗原，被釋放的抗原表位可以被酶標(biāo)抗體重新識別。通過酶活性監(jiān)測結(jié)果。

　　這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于固相抗體和檢測抗體可以是同一種抗體，省去了傳統(tǒng)的雙抗體夾心法需要篩選針對不同抗原決定簇的兩種抗體的復(fù)雜程序;而局限性則在于要求目標(biāo)分析物含有氨基官能團(tuán)。該方法已被發(fā)展到甲狀腺素、白三烯C43等的測定。

　　當(dāng)然，對于很多不含有氨基的半抗原分子，如促甲狀腺激素釋放激素(TRH)，可通過化學(xué)修飾引入氨基基團(tuán),再進(jìn)行SPIE-IA反應(yīng)。也可以通過紫外輻照或類Fenton試劑產(chǎn)生的羥基自由基觸發(fā)的方式實(shí)現(xiàn)半抗原與固相抗體的直接交聯(lián)。但是，紫外線照射一定程度上也會降解免疫復(fù)合物，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

　　同樣，這種方法涉及對待檢物共價偶聯(lián)，并用變性的方法釋放待檢物，對樣本產(chǎn)生諸多干擾，作為一種探索方法算是創(chuàng)新了，但是無法適應(yīng)現(xiàn)代檢測高效，快速，準(zhǔn)確的理念，導(dǎo)致無法在臨床檢驗(yàn)中有效推廣和應(yīng)用‌。

Open sandwich

　　1996年Ueda等(Ueda H, Tsumoto K, Kubota K, Suzuki E, Nagamune T, Nishimura H, et al.Open sandwich ELISA: a novel immunoassay based on the interchain interaction of antibody variable region[J]. Nature Biotechnology, 1996, 14(13): 1714-1718.)首次報(bào)道了在抗原存在時，抗體重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)的結(jié)合穩(wěn)定性得到增強(qiáng)這一現(xiàn)象，并提出了開放式夾心免疫分析法(Open Sandwich Immunoassay , OS-IA)的概念，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于其適用性與靶標(biāo)分析物的分子量無關(guān)。

　　其原理是游離VL和VH相互作用非常弱，在低濃度下趨于解離狀態(tài)，但是在相應(yīng)抗原存在時，VL與VH會通過抗原“橋梁”作用提高相互結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性。目前，該方法已成功應(yīng)用于玉米赤霉烯酮、赤霉醇、雙酚A、骨鈣素、類固醇、雌激素、甲狀腺素T4以及膝溝藻毒素的檢測。

　　然而，這種方法由于抗體的制備與篩選、編碼VH與VL的 DNA片段的構(gòu)建以及融合蛋白的表達(dá)與純化等過程較為復(fù)雜，而且并非所有的抗體VH/VL間的相互作用都與抗原有關(guān)，需要選擇合適的抗體來建立OS-IA體系，在推廣應(yīng)用上仍存在一定的難度。

基于酶標(biāo)記分析物

　　1999年Giraudi等(Giraudi G, Anfossi L, Rosso I, et al. A general method to perform a noncompetitive immunoassay for small molecules. Analytical Chemistry, 1999, 71(20 ) : 4697-4700)提出了基于酶標(biāo)記分析物-分析物抗體位點(diǎn)置換反應(yīng)來檢測半抗原的非競爭性免疫分析方法，該方法原理是在封閉劑存在下，基于抗體與酶標(biāo)記分析物和分析物結(jié)合親和力的差異，酶標(biāo)記分析物競爭置換分析物進(jìn)而檢測分析物，該方法的關(guān)鍵在于有效封閉。其反應(yīng)過程大致如下:

　　1、固定化抗體捕獲分析物;

　　2、使用封閉劑封閉分析物中多余的抗體結(jié)合位點(diǎn);

　　3、抗體捕獲的分析物被標(biāo)記分析物置換取代;

　　4、最后，標(biāo)記后的分析物信號強(qiáng)度與分析物濃度呈正相關(guān)。

基于抗免疫復(fù)合物抗體的非競爭性免疫分析方法

　　抗免疫復(fù)合物抗體是針對抗原與抗體結(jié)合后形成的新的抗原表位所產(chǎn)生的特異性抗體，又叫抗異型抗體(Anti-metatype Antibody)。該抗體只能識別抗原抗體復(fù)合物，對單獨(dú)存在的抗原或抗體幾乎沒有作用。

　　1994年Self等(Self C H, Dessi J L, Winger L A. High-performance assays of small molecules：enhanced sensitivity, rapidity,and convenience demonstrated with a noncompetitive immunometric anti-immune complex assay system for digoxin. Clinical Chemistry, 1994, 40(11): 2035-2041.)建立了基于抗免疫復(fù)合物抗體檢測地高辛的非競爭性免疫分析方法。此方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要對樣本進(jìn)行化學(xué)處理和純化，完全符合現(xiàn)代檢測高效，快速，準(zhǔn)確的理念。

　　這種方法的缺點(diǎn)是：抗免疫復(fù)合物抗體很難獲得，主要原因在于抗體結(jié)合抗原后引起的免疫復(fù)合物的空間構(gòu)象變化細(xì)微，且半抗原高達(dá)85%的可及表面包埋于抗體內(nèi)部，難以形成新的有效的抗原決定簇。并且在篩選過程中,由于抗免疫復(fù)合物抗體與Ab1以及分析物組成的三元復(fù)合物相互間的接觸表面積較大,無法實(shí)現(xiàn)對免疫復(fù)合物空間構(gòu)象變化的精準(zhǔn)識別，從而造成較高的非特異性干擾。

　　基于噬菌體展示技術(shù)(Phage-displayed Library )則較好地解決了這一問題，研究者發(fā)現(xiàn)噬菌體展示短肽能夠識別抗原抗體復(fù)合物從而發(fā)展出了噬菌體抗免疫復(fù)合物分析法(phage anti-immune complex assay, PHAIA)，在小分子化合物的非競爭性免疫分析領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

　　基于抗免疫復(fù)合物抗體的非競爭性免疫分析方法從本質(zhì)上規(guī)避了競爭法帶來的固有缺陷，多家國產(chǎn)IVD公司投入大量時間和成本研發(fā)，并實(shí)現(xiàn)了突破，大量數(shù)據(jù)結(jié)果表明顯示小分子夾心法與LC-MS/MS方法高度一致，同時靈敏度和特異性也有了質(zhì)的飛躍，可以進(jìn)一步拓展和深化臨床應(yīng)用研究，同時也可以為小分子檢測項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)化提供更多科學(xué)證據(jù)。此方法將逐漸發(fā)展成檢測小分子化學(xué)化合物夾心法的主流技術(shù)。

寫在最后

　　隨著小分子化合物夾心法檢測研究的深入，逐漸發(fā)展出來基于抗體-適配體的夾心法，基于適配體-適配體的夾心法。

　　相比抗體和抗體的夾心模式，通過使用適配體和抗體的夾心組合可以有效降低空間位阻效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)針對小分子的夾心檢測。

　　此外，篩選合適的適配體是成功建立適配體-分析物-抗體夾心檢測的關(guān)鍵。

　　技術(shù)的迭代和創(chuàng)新是推動社會進(jìn)步和發(fā)展的重要動力，而這一過程往往是由市場需求和技術(shù)本身的進(jìn)步共同驅(qū)動的。創(chuàng)新技術(shù)和產(chǎn)品的開發(fā)最終都需要落地于臨床和檢驗(yàn)，高質(zhì)量服務(wù)于臨床和檢驗(yàn)，小分子夾心法免疫分析技術(shù)的突破帶來了產(chǎn)品性能多維度的提升，從本質(zhì)上規(guī)避了競爭法帶來的方法學(xué)的缺陷，如精密度欠缺、準(zhǔn)確度不夠、易受干擾、線性范圍窄等，其臨床應(yīng)用存在較多的局限性和爭議。LC-MS/MS作為小分子檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，具有優(yōu)異的特異性和準(zhǔn)確度，然而，其通量低、前處理復(fù)雜、對設(shè)備和人員要求高等缺點(diǎn)限制了其廣泛使用。

　　在未來，開發(fā)一種兼顧免疫學(xué)方法和LC-MS/MS方法兩者優(yōu)勢的檢測技術(shù)來檢測小分子化合物成為檢驗(yàn)技術(shù)和檢驗(yàn)行業(yè)的使命之一，需要所有檢驗(yàn)人攜手共進(jìn)，共同努力，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代檢驗(yàn)高效，快速，準(zhǔn)確的理念。