備受期待的非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒名單終于公布了，我為大家準(zhǔn)備了一些非瘟抗體ELISA知識(shí)點(diǎn)，能讓大家在被口吐蓮花的銷售代表忽悠時(shí)保持一顆平常心。

　　33個(gè)非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒中有3種類型的ELISA，分別是間接ELISA(17個(gè))，阻斷ELISA(12個(gè))和夾心ELISA(4個(gè))。依據(jù)的是國(guó)標(biāo)《非洲豬瘟診斷技術(shù)》(GB/T18648-2020)中的三種ELISA抗體檢測(cè)方法。

1.間接ELISA

IgG抗體，

間接ELISA通常用于測(cè)定血清中理論上也可以檢測(cè)IgM抗體，但是IgM抗體通常使用捕獲ELISA來(lái)檢測(cè)。間接ELISA是應(yīng)用最廣泛的ELISA方法，由于只要獲得抗原，配合通用的酶標(biāo)抗豬IgG的二抗就可以快速建立ELISA方法。產(chǎn)品性能取決于抗原的純度，抗原純度不夠會(huì)導(dǎo)致非特異IgG的結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性。

　　實(shí)驗(yàn)流程通常為：

　　1)準(zhǔn)備好包被了已知定量的抗原的ELISA板。

加樣：

2)加待檢測(cè)的樣品。溫育反應(yīng)一定時(shí)間，如果血清中含有針對(duì)包被抗原的抗體，則待檢抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。

加酶標(biāo)二抗：

3)加入酶標(biāo)抗抗體(二抗)，該酶標(biāo)二抗與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗原—待測(cè)抗體—酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，溫育，洗滌。

顯色：

4)加入底物溶液，溫育一定時(shí)間后，固相上酶的催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，

終止：

5)加入終止液終止顯色反應(yīng)。

讀數(shù)：

6)使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度值(OD值)。

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2.阻斷ELISA/競(jìng)爭(zhēng)ELISA

IgG抗體

阻斷ELISA/競(jìng)爭(zhēng)ELISA通常用于測(cè)定血清中。阻斷ELISA/競(jìng)爭(zhēng)ELISA需要抗原和特異性的單抗或多抗。對(duì)抗原的純度要求不高，產(chǎn)品的性能取決于單抗或多抗的特異性和親和力。背景干擾低，特異性高。

　　實(shí)驗(yàn)流程通常為：

　　1)準(zhǔn)備好包被了已知定量的抗原的ELISA板。

加樣：

2)加待檢測(cè)的樣品。溫育反應(yīng)一定時(shí)間，如果血清中含有針對(duì)包被抗原的抗體，則待檢抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。

加競(jìng)爭(zhēng)抗體：

3)加入酶標(biāo)單抗或多抗，該酶標(biāo)單抗或多抗與待測(cè)樣品競(jìng)爭(zhēng)性與包被抗原結(jié)合，形成抗原—酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，溫育，洗滌。

顯色：

4)加入底物溶液，溫育一定時(shí)間后，固相上酶的催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，

終止：

5)加入終止液終止顯色反應(yīng)。

讀數(shù)：

6)使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度值(OD值)

3.雙抗原夾心ELISA

IgM、IgG、IgA等

雙抗原夾心ELISA用于測(cè)定血清中。技術(shù)難度最高，需要制備高質(zhì)量的酶標(biāo)抗原。該方法不受非特異性IgG的干擾，背景干擾小，敏感性和特異性高。

　　實(shí)驗(yàn)流程通常為：

　　1)準(zhǔn)備好包被了已知定量的抗原的ELISA板。

加樣：

2)加待檢測(cè)的樣品。溫育反應(yīng)一定時(shí)間，如果血清中含有針對(duì)包被抗原的抗體，則待檢抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。

加酶標(biāo)抗原：

3)加入酶標(biāo)抗原，該酶標(biāo)抗原與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗原—待測(cè)抗體—酶標(biāo)抗原的復(fù)合物，溫育，洗滌。

顯色：

4)加入底物溶液，溫育一定時(shí)間后，固相上酶的催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，待測(cè)樣品中

終止：

5)加入終止液終止顯色反應(yīng)。

讀數(shù)：

6)使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度值(OD值)。

根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道具有診斷學(xué)意義的蛋白主要有P72(VP73)蛋白、P54蛋白、P30(P32)蛋白、PP62(P60)蛋白。

1.P72（VP73）蛋白

　　結(jié)構(gòu)蛋白，由B646L基因編碼，分子量約為73.09kDa。VP73在大多數(shù)毒株中相當(dāng)穩(wěn)定，能與所有感染豬的血清發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，且其抗原性非常穩(wěn)定。該蛋白是血清學(xué)診斷方法的理想抗原，常被用于抗體檢測(cè)。

2.P54蛋白

　　結(jié)構(gòu)蛋白，由E183L基因編碼，大小約25kDa。在病毒感染的早期階段發(fā)揮作用，是病毒的復(fù)制必需蛋白。P54蛋白具有較好的免疫原性，其產(chǎn)生的抗體能夠阻斷病毒顆粒粘附到易感細(xì)胞上，該蛋白較為保守，產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

3.P30（P32）蛋白

　　主要結(jié)構(gòu)蛋白，由CP204L基因編碼，在病毒感染的早期表達(dá)，可用于ASF感染早期診斷。

4.PP62（P60）蛋白

　　由CP530R基因編碼，在病毒復(fù)制晚期表達(dá)，經(jīng)過(guò)加工生成P35蛋白和P15蛋白。

　　用于 ASFV 抗體檢測(cè)的抗原及其作用

　　可能會(huì)有很多人開(kāi)始糾結(jié)于到底選擇包被哪種蛋白的試劑盒，個(gè)人覺(jué)得對(duì)于ELISA試劑盒來(lái)說(shuō)，蛋白選擇固然重要，但是試劑盒的生產(chǎn)工藝對(duì)試劑性能的影響更大。

三、非洲豬瘟病毒抗體消長(zhǎng)

　　根據(jù)ReisAL試驗(yàn)數(shù)據(jù)，E183L/ p54, K205R, A104R/histone-like 和 B602L抗體反應(yīng)強(qiáng)，14天IgG抗體100%轉(zhuǎn)陽(yáng)，持續(xù)39天以上。B646L/p73, CP204L/p32, CP312R, NP419L/DNA ligase 和F334L抗體反應(yīng)中等，14天IgG抗體未100%轉(zhuǎn)陽(yáng)，但可以檢測(cè)到。K196R, K78R/p10 和 C44L抗體較弱。。

　　ASFV12種蛋白的IgG抗體

　　E183L/ p54, K205R, A104R/histone-like和B602L四種蛋白的IgM抗體7天可以檢測(cè)到，14天開(kāi)始下降。

　　ASFV4種蛋白的IgM抗體

四、抗體檢測(cè)的確診方法

（以某個(gè)品牌的所謂進(jìn)口試劑盒去評(píng)價(jià)其他ELISA試劑盒的方法是錯(cuò)誤的）

ELISA雖然簡(jiǎn)單易得，但是ELISA應(yīng)用于篩查檢測(cè)時(shí)仍然會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。那么用什么方法去作為ELISA方法的確診方法呢?

　　根據(jù)OIE陸生動(dòng)物手冊(cè)，可以使用間接免疫熒光(indirect fluorescent antibody，IFA)、間接免疫酶(indirect immunoperoxidase test ，IPT))和免疫印跡(immunoblotting ，IB)的方法作為ELISA實(shí)驗(yàn)的確診方法。

　　(The most commonly used is the ELISA , which is suitable for examining serum or plasma. Confirmatory testing of ELISA-positive samples should be carried out using an alternative test, such as the IFAT, IPT or immunoblotting)

五、ELISA試劑盒的選擇

　　市場(chǎng)上一下出現(xiàn)33個(gè)合法ELISA試劑盒究竟那個(gè)好呢，公告里也沒(méi)告訴大家詳細(xì)的比對(duì)數(shù)據(jù)，只能自己去選擇了。

1.看研發(fā)實(shí)力

2.看試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.看臨床應(yīng)用

4.開(kāi)展試劑盒評(píng)價(jià)

　　實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備一定的試劑評(píng)價(jià)能力，評(píng)價(jià)方法見(jiàn)：診斷試劑評(píng)價(jià)系列3-血清檢測(cè)方法。

六、不同使用場(chǎng)景下ELISA試劑盒的使用

1.魚(yú)和熊掌不可兼得

　　世界上不存在敏感性和特異性都是100%的診斷試劑。ELISA試劑盒的敏感性和特異性就像一個(gè)蹺蹺板，每個(gè)廠家都會(huì)根據(jù)自己產(chǎn)品的定位找一個(gè)平衡點(diǎn)?；蛘咭舾行愿咭恍奚禺愋裕蛘咭禺愋愿咭恍奚舾行?，或者取敏感性和特異性都不是最高，但是很均衡。

2.使用場(chǎng)景的選擇

3.組合應(yīng)用

對(duì)于發(fā)病場(chǎng)的篩查，需要先使用高敏感性的試劑進(jìn)行初篩，陽(yáng)性樣品再用高特異性的試劑進(jìn)行復(fù)核。

　　核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)也需要定期組合檢測(cè)，保證豬群的雙陰性。

　　一年來(lái)豬價(jià)起伏，養(yǎng)豬人實(shí)屬不易。希望診斷試劑廠家能夠真正為產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造價(jià)值，為非瘟防控提供有效的工具。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]王功民，田克恭.非洲豬瘟[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2010年.

　　[2]田克恭，李明.動(dòng)物疫病診斷技術(shù)：理論與應(yīng)用[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2014年.

　　[3]AFRICAN SWINE FEVER: DETECTION AND DIAGNOSIS.FAO

　　[4]AFRICAN SWINE FEVER.3.08.01.OIE

　　[5]ReisAL, Parkhouse RME, Penedos AR, Martins C, Leitão A. Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally with African swine fever virus. J Gen Virol. 2007 Sep;88(Pt 9):2426-2434.