一文讀懂分子診斷三大技術：qPCR、二代測序NGS和數(shù)字PCR！
發(fā)布時間：2023-03-15 15:43:50來源：
分子診斷是將分子生物學技術應用于疾病診斷的醫(yī)學分支學科，利用分子生物學技術研究人體內源性或外源性生物分子的存在、結構或表達調控變化，為疾病的預防、預測、診斷、治療、預后和轉歸提供信息和決策依據(jù)。精準醫(yī)療的發(fā)展，將持續(xù)推動分子診斷的進步。目前常見核酸分子診斷技術涉及三個技術：熒光定量PCR技術（qPCR）、高通量測序技術（NGS）和數(shù)字PCR。如何選擇，我們作一下簡要介紹。
qPCR
在1983年，美國人Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction, PCR),這一技術將DNA的變性原理以及復性原理加以利用，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復性，讓核酸片段實現(xiàn)了體外擴增，可將極微量的目標DNA特異地擴增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測，因為PCR有著很高的靈敏度以及特異性，而且簡便快速，所以這種技術已經(jīng)成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高的技術。
qPCR通過熒光染料或熒光特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時監(jiān)控反應過程。每擴增一條DNA鏈，就有熒光染料分子結合到雙鏈DNA上或有熒光分子從探針上釋放，實現(xiàn)熒光信號的累積。由于熒光積累與PCR產(chǎn)物形成完全同步，可通過軟件對熒光積累信息進行分析和計算，獲得待測樣品模板的初始濃度。但是，qPCR只能夠通過標準曲線和標準品進行相對定量，無法做到精準絕對定量。
NGS
基因測序是直接獲得核酸序列信息的唯一技術手段,是分子診斷技術的一項重要分支。雖然分子雜交、分子構象變異或定量PCR技術在近幾年已得到了長足的發(fā)展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術上的金標準。
NGS可以一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。在基因組水平上，NGS可進行從頭測序而獲得該物種的全長序列，為后續(xù)研究奠定基礎；對已知參考序列的物種，進行全基因組重測序可檢測新的突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上，NGS可進行全轉錄組測序，開展可變剪接、基因表達差異、新非編碼RNA分子發(fā)現(xiàn)等研究。
NGS與染色質免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技術相結合，可檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。NGS功能強大，適合用于探索篩選新的生物標志物，但是實驗操作較復雜，數(shù)據(jù)分析難度較大，檢測周期長，成本較高。
數(shù)字PCR
數(shù)字PCR是新興起來的一種核酸分子絕對定量技術。該技術可直接獲得DNA分子的拷貝數(shù)，實現(xiàn)起始樣品中核酸分子的絕對定量，且無需標準品或內標。數(shù)字PCR已經(jīng)被廣泛應用到醫(yī)學、生物學等各個領域，如拷貝數(shù)變異、突變檢測、復雜來源樣品中低豐度核酸分子檢測、NGS數(shù)據(jù)驗證、miRNA等微小差異表達研究、單細胞基因表達分析等方面，在已知突變的癌癥分子標志物的檢測、傳染病病原體檢測、基因組三倍體分析和基因表達分析等領域展現(xiàn)了強大的優(yōu)勢。
總結
在實驗過程中，大家會有疑問：選擇哪種檢測技術才能更好的達到預期結果？通過突變檢測限、定量能力、操作簡易程度、檢測費用、適用場所、發(fā)現(xiàn)未知序列等方面進行比較，您或許會有自己的答案。
從上表來看，數(shù)字PCR因為靈敏度高、絕對定量、適合于醫(yī)院操作等優(yōu)點，在腫瘤液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、感染性疾病早期診斷等臨床檢測應用方面具有顯著優(yōu)勢。NGS在檢測未知序列、未知突變、高通量多位點檢測方面是更好的選擇，是科研和獨立實驗室服務的好工具。qPCR適用于較常規(guī)的臨床分子診斷項目。
總的來看，分子診斷技術的應用不僅深化對疾病發(fā)病機制分子生物學的基礎研究，而且不斷擴大了分子診斷疾病的病種，隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質組計劃的啟動，分子診斷方法將極大地推動現(xiàn)代檢驗醫(yī)學的迅速發(fā)展，并通過這些基本技術的衍生、聯(lián)合產(chǎn)生新的分析方法，從而提高分子診斷的特異性、敏感性和準確性，為臨床醫(yī)學診斷和治療提供更準確的數(shù)據(jù)和信息。